липополисахарид связывающий белок для чего назначают

Характер изменений уровня липополисахарид-связывающего белка при различных инфекционных процессах и дисбиозах

В качестве одного из наиболее патогенетически значимых факторов в настоящее время рассматривают липополисахариды (LPS, или эндотоксин) грамотрицательных бактерий. В частности, с эндотоксинемией связывают отдельные звенья патогенеза дисбактериоза, кишечных инфекций и многих других заболеваний. При массивной LPS-обусловленной эндотоксинемии системный ответ организма может становиться неконтролируемым, что сопровождается маргинальным лейкостазом, гранулоцитопенией, истощением миелопоэза, высвобождением лизосомальных ферментов нейтрофилами, повышением сосудистой проницаемости («капиллярная протечка») и перераспределением жидкости из сосудистого русла в прилегающие ткани. Указанное диктует необходимость мониторинга биологических эффектов LPS в процессе этиологической диагностики и при принятии решений на фоне неотложных состояний.

LPS в системном кровотоке присутствуют в агрегированном состоянии, что снижает интенсивность их взаимодействия с лейкоцитами и выраженность клеточного иммунного ответа. Агрегация LPS и соответствующее ослабление его биологических эффектов происходит в результате мономеризации молекулы при участии одного из белков острой фазы, конституитивно синтезируемого в печени, эпителии кишечника и легких под воздействием IL-1 и IL-6 и обозначаемого как человеческий белок, связывающий LPS (LBP).

Следовательно, не исключается перспектива использования LBP в качестве количественного маркера динамики эндотоксинемии, значение которого, в частности, было показано при сепсисе.

Цель исследования – оценка диагностической значимости определения уровня LBP при различных инфекционных процессах и дисбиозах.

Исследованы сыворотки больных сальмонеллезом, урогенитальным хламидиозом, внебольничной пневмонией, полипозным риносинуситом и бактериальным вагинозом. Уровень LBP при сальмонеллезе был ниже, нежели у здоровых, и снижался при увеличении степени тяжести заболевания. При хламидиозе выявлены более высокие значения LBP. При внебольничной пневмонии показана прямая корреляция уровня LBP с этиологией и тяжестью заболевания. При полипозном риносинусите концентрация LBP обратно коррелировала с продолжительностью заболевания и прямо – с продолжительностью ремиссии. При бактериальном вагинозе выявлено двукратное увеличение средней концентрации LBP в крови и зависимость от длительности дисбиоза.

При различных патологических состояниях и дисбиозах наблюдается разнонаправленная модуляция антиэндотоксиновой защиты. (См. статью: Мавзютов А.Р. с соавт. «Характер изменений уровня липополисахарид-связывающего белка при различных инфекционных процессах и дисбиозах»).

Источник

Липополисахарид связывающий белок для чего назначают

Несмотря на обширный арсенал комплексной терапии панкреонекроза в ведущих специализированных клиниках, вскрытие гнойника является неизбежным этапом в лечении тяжелого инфицированного панкреонекроза [4]. Ранняя диагностика гнойных осложнений с выставлением своевременных показаний к операции в настоящее также является одной из немногих реальных возможностей улучшить результаты лечения деструктивного панкреатита. Помимо клинико-инструментальных обследований в последнее время активно идет поиск биохимических маркеров абдоминального сепсиса, среди которых в качестве наиболее информативного принято считать уровень прокальцитонина. Течение острого панкреатита является фазным процессом, что отчетливо наблюдается нами при ранней госпитализации больных. Возрастание концентрации прокальцитонина выше определённых пороговых значений в комплексе с клиническими данными является сигналом к переходу от «стерильного» панкреонекроза к инфицированному, при этом сроки, описанные в литературе, даже с учетом определения современных предикторов лежат в пределах 2 недель. Изучение патофизиологических реакций в организме, происходящих в это время, с оптимизацией лечебных мероприятий, на наш взгляд, являются не менее важным этапом лечения деструктивного панкреатита, чем адекватная инфузионная терапия в начальной фазе заболевания или хирургическая тактика в фазу гнойных осложнений. Изучение патогенетических аспектов СКН, в частности особенностей течения системного воспалительного ответа на бактериальные липополисахариды, поможет в дальнейшем при оптимизации лечебной тактики.

Целью исследования явилась оценка динамики уровня бактериальных липополисахаридов (LPS) при деструктивном панкреатите и уровня липополисахарид-связывающего (LBP) белка как ведущего фактора эндотоксиновой защиты.

Определение уровня липополисахаридов проводили с помощью LAL-теста (хромогенный тест) набора реактивов (HIT302)HycultBiotech, Голландия. LBP методом иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием набора реактивов (HK315-02)HycultBiotech, Голландия. Забор крови в основной группе и определение исследуемых показателей проводили при поступлении больного и далее ежедневно до 10 суток при положительной динамике заболевания и 14 суток при тяжелом течении процесса, т.е. срока формирования гнойников. В группе сравнения исследования проводили при поступлении. Полученные показатели оценивали в сопоставлении с клиническими проявлениями заболевания.

Результаты и обсуждение

Нами проведено ретроспективное распределение больных основной группы по степени поражения поджелудочной железы, развитию гнойных осложнений и летальности (табл.1).

Тяжесть поражения поджелудочной железы в основной группе

Источник

Медицинские интернет-конференции

Языки

Влияние ЛПС Escherichia coli O111:B4 на морфологию мембраны эритроцитов

Китаева А.А., Слюсаренко Ю. А., Долгов А. А., Швецов А. В.
Научный руководитель: д.м.н., профессор В.Б. Бородулин

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для проведения эксперимента использовались беспородные самцы белых мышей массой 30г. Кровь собиралась путем декапитации в центрифужные пластиковые пробирки с раcтвором цитрата натрия 3,8%. Экспериментальная работа выполнена в соответствии с протоколами Женевской конвенции и принципами надлежащей лабораторной практики. В исследовании использовали LPS из Escherichiacoli в 2 концентрациях: 3, 5 и 7 * 10-4 г/мл. С каждой концентрацией производилась инкубация 15 и 30 мин. и делался мазок крови на стекле. Морфологическое исследование эритроцитов осуществляли при помощи иммерсионной световой микроскопии. Оценку морфологии эритроцитов проводили по классификации В. Н. O’Conner. Статистическая обработка выполнена с помощью программы «STATISTICA 10», достоверность различий устанавливали с помощью U-критерия Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

При постоянной концентрации ЛПС 3,5 * 10-4 г/мл, но разном времени инкубирования получаются следующие результаты: дискоцитов уменьшилось на 16 %, эхиноцитов увеличилось на 12 %, а шизоцитов увеличилось на 4 %. Изменения такого же характера, но более глубокие, наблюдаются при увеличении концентрации до 7 * 10-4 г/мл: дискоцитов уменьшилось на 74 %, эхиноцитов увеличилось на 63 %, а шизоцитов увеличилось на 9 %. При постоянном времени инкубирования, но разных концентрациях изменения ещё более значительны, например, при времени инкубирования t= 30 мин и при концентрациях C 1 = 3,5 * 10-4 г/мл, C 2 = 7 * 10-4 г/мл дискоцитов уменьшилось на 83 %, эхиноцитов увеличилось на 200 %, а количество шизоцитов на 73 %. Таким образом, можно сделать вывод, что ЛПС негативно влияет на эритроциты, изменяя их морфологию. Изменения зависят как концентрации, так и от времени инкубации.

Источник

Почему необходимо определение С-реактивного белка?

С-реактивный белок – это главный маркер острой фазы воспаления. Его синтез увеличивается уже через 6 часов, а концентрация в крови возрастает в 10-100 раз в течение 24-48 часов после начала воспаления. Наиболее высокие уровни СРБ наблюдаются при бактериальной инфекции. При вирусной инфекции уровень СРБ, как правило, не превышает 20 мг/л. Концентрация СРБ также повышается при некрозе тканей (в том числе при инфаркте миокарда, опухолевых некрозах). Повышение СРБ может предшествовать появлению лихорадки, боли и других признаков болезни. Некоторые специалисты определяют длительность антибактериальной терапии в зависимости от сроков снижения СРБ. Относительно повышенный уровень СРБ даже при нормальном уровне холестерина у практически здоровых лиц позволяет прогнозировать риск возникновения гипертонической болезни, инфаркта миокарда, инсульта, внезапной сердечной смерти, сахарного диабета 2-го типа и облитерирующего атеросклероза периферических сосудов. У больных ишемической болезнью сердца чрезмерное содержание СРБ является плохим признаком и свидетельствует о высоком риске повторного инфаркта, инсульта, рестеноза при ангиопластике и осложнений после аортокоронарного шунтирования. Также в настоящее время определение уровня СРБ рекомендуется с целью выявления осложнений при новой короновирусной инфекции COVID-19.

Как правильно подготовиться к исследованию? Какой биоматериал используется для анализа? Что определяется в процессе анализа?

Что может повлиять на результат исследования?

На фоне приёма аспирина, нестероидных противовоспалительных препаратов, кортикостероидов, статинов и бета-блокаторов уровень СРБ может снижаться.

Уровень СРБ может быть повышен при употреблении алкоголя, жирной пищи накануне исследования. Любая спортивная или бытовая травма приводит к повышению СРБ. Среди факторов повышающих уровень СРБ также интенсивные физические нагрузки, беременность, пероральные контрацептивы, заместительная гормональная терапия, бессоница, наличие в организме инородных тел (протезов, имплантов),

Как оценить полученные результаты?

В норме уровень СРБ составляет от 0 до 5 мг/л, но грамотную оценку полученным результатам может дать только врач. При этом он будет учитывать не только результат анализа СРБ, но и жалобы, данные объективных исследований и других анализов. Можно отметить, что после травмы или операции при отсутствии осложнений, концентрация СРБ возвращается к норме в следующие 5-7 сут. Сниженный уровень С-реактивного белка диагностического значения не имеет.
Если же анализ выполнялся «для себя», то повышенный уровень СРБ это повод как можно быстрее обратиться к врачу для проведения дополнительных обследований с целью уточнения характера и локализации патологического процесса.

Увеличение содержания С-реактивного белка может отмечаться при следующих состояниях:

— 10-40 мг/л – вирусные и умеренные бактериальные инфекции; хронические инфекции (туберкулез, сифилис); инфаркт миокарда (максимум после 2 сут); саркоидоз; ревматоидный артрит; псориатический артрит, подагра; заболевания соединительной ткани, такие как системная красная волчанка, дерматомиозит; язвенный колит; внутриутробная инфекция

— 40-200 мг/л – острое воспаление и бактериальные инфекции средней степени тяжести, после травмы или хирургического вмешательства; тяжелые бактериальные инфекции, в том числе послеоперационные, инфекции (пневмония, пиелонефрит); активный ревматоидный артрит; крайне активный серонегативный спондилоартрит; системные васкулиты; активная болезнь Крона; тромбоз глубоких вен; острый панкреатит; метастазирующие некротизирующие опухоли

— 300 – 700 мг/л- тяжелые травмы, ожоги, сепсис;

ВАЖНО!

Источник

Новые лекарства при аутоиммунных заболеваниях (мегагрант 2014-2016 гг)

Проект «Новые лекарства и принципы анти-ФНО терапии при аутоиммунных заболеваниях» (мегагрант 2014-2016 гг)

Цель проекта:

Сравнительная оценка нескольких новых блокаторов ФНО*, создание условий для их последующего производства и клинического применения.

Задачи проекта:

— Создать и оценить в экспериментальных системах на мышах нового типа блокаторы ФНО, которые бы фармакологически нейтрализовали ФНО только из основного патогенного источника.
— Отработать экспериментальную модель фармакологической блокировки ФНО человека на «гуманизованных» мышах при артрите с использованием коммерчески доступных анти-ФНО-препаратов (Infliximab или Adalimumab, Etanercept и Certolizumab pegol).
— Изучить патогенез ФНО при аутоиммунных заболеваниях с помощью недавно созданных «репортерных» мышей и систем прижизненного имиджинга, разработанных в Медицинской академии и ННГУ.
— Создать платформу для доклинической оценки нескольких новых химеризованных и гуманизованных антагонистов ФНО на основе антител.
— Разработать панель новых биспецифических ФНО-блокаторов на основе однодоменных антител верблюда и способных блокировать ФНО на поверхности определенных типов клеток (например, макрофаги или B-клетки). Определить сродство и фармокинетику новых биспецифических антител и оценить их эффективность в экспериментальных болезнях на гуманизованных мышах.
— Оценить влияние Etanercept/Enbrel по сравнению с Infliximab и Certolizumab pegol на системные уровни IgA и состав микробиоты в гуманизованных мышах.

Результаты (проекты):

ПОЛУЧЕНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ КОНСТРУКТА, КОДИРУЮЩЕГО СЛИТНЫЙ БЕЛОК, СОСТОЯЩИЙ ИЗ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИТЕЛА ЛАМЫ, СВЯЗЫВАЮЩЕГО ФНО, И ЦВЕТНОГО БЕЛКА, ФЛУОРЕСЦИРУЮЩЕГО В КРАСНОЙ ЧАСТИ СПЕКТРА.

Фактор некроза опухоли (ФНО) является провоспалительным цитокином. В норме, ФНО играет важную роль в защите организма от патогенов, а также участвует в формировании иммунной системы. Однако, при многих аутоиммунных заболеваниях (в частности, при ревматоидном артрите и болезни Крона) отмечена гиперэкспрессия ФНО. В связи с этим, важным для понимания роли ФНО как в патологических, так и в нормальных процессах является изучение сайтов экспрессии этого цитокина. У представителей семейства Camelidae помимо обычных антител присутствуют особые антитела, состоящие только из тяжёлых цепей. Несмотря на отсутствие лёгких
цепей, такие антитела с высокой аффинностью связывают антиген. Описаны одноцепочечные рекомбинантные антитела, представляющие собой вариабельный участок тяжёлой цепи антитела ламы. Эти антитела представляют собой наименьший известный антиген-распознающий элемент. Такие одноцепочечные антитела были получены и против ФНО человека. Благодаря достаточно высокой аффинности и
крайне малым размерам этих антител их можно использовать для создания слитных белков (fusion proteins), в частности с флуоресцентными белками. Одним из наиболее подходящих для визуализации структур на уровне целого организма флуоресцентных белков является белок Katushka. Нами были получены конструкты, кодирующие слитные белки одноцепочечных рекомбинантных антител, связывающих ФНО человека, и Katushka. Полученные конструкты были проэкспрессированы в бактериальной системе (E. сoli). Рекомбинантный белок сохранил способность к флуоресценции в красной области спектра. В настоящее время изучаются биологические свойства слитного белка, в том числе способность слитного белка связывать ФНО и визуализировать в организме места его продукции и накопления. Использование связывающего ФНО цветного слитного белка в качестве маркёра в экспериментах на мышиных моделях (в первую очередь, на мышах, “гуманизованных” по ФНО локусу), позволит изучить, в каких тканях происходит экспрессия этого цитокина, в том числе и при заболеваниях, являющихся моделями заболеваний человека.

Прижизненная визуализация областей гиперэкспрессии TNF в модельном аутоиммунном артрите с помощью флуоресцентного сенсора Vhh41-K (Ефимов Г.А., Недоспасов С.А., неопубликованные данные)

АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ TNF В МОДЕЛИ ОСТРОГО ВОСПАЛЕНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕПОРТЕРНЫХ МЫШЕЙ С КРАСНЫМ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ БЕЛКОМ

Ранее в лаборатории ведущего ученого была создана новая линия репортерных мышей (TNF-2A-Кat), содержащих в виде трансгена фрагмент гена TNF с его регуляторными элементами, слитый с геном красного флуоресцентного белка Катюшка (Kat). Таким образом, в геном линии трансгенных TNF-2A-Кat репортерных мышей вставлена генетическая конструкция, позволяющая совместно экспрессировать ген TNF и ген-репортер флуоресцентного белка. Конструкция содержит большинство известных регуляторных элементов гена TNF, что позволяет идентично регулировать экспрессию трансгена и гена TNF клетки. Совместно с НИИ Биомедицинских технологий НижГМА были получены данные по флуоресцентному in vivo имиджингу TNF-2A-Кat репортерных мышей.Так, при сравнении флуоресцентных изображений in vivo было обнаружено, что интенсивность сигнала флуоресценции некоторых тканей TNF-2A-Kat мышей, в частности, кожи, значительно выше по сравнению с интенсивностью сигнала от тканей мышей дикого типа:

Типичные флуоресцентные изображения, полученные in vivo на мышах TNF-2A- Kat (верхний ряд) и мышах дикого типа (нижний ряд) : А – со стороны спины, Б – с левого бока, В – со стороны живота (яркие желтые пятна являются артефактом аутофлуоресценции).

При сравнительном флуоресцентном имиджинге ex vivo внутренних органов TNF-2A-Kat мышей и мышей дикого типа, таких как мышцы, кишечник, желудок, сердце, селезёнка, почки, лимфатические узлы, печень и лёгкие животных. Оценка флуоресценции органов показала, что хотя интенсивность сигнала от кожи, мышц, кишечника, лимфоузлов и легких была выше у TNF-2A-Kat мышей, статистически значимые отличия в интенсивности флуоресценции между двумя группами мышей наблюдались только для кожи и мышечной ткани. Этот результат, полученных на наивных здоровых мышах, разводка которых происходит в SPF виварии, позволил предположить, что активация гена TNF в клетках кожи может быть обусловлена эффектами микробиоты. Эта возможность сейчас исследуется с помощью применения антибиотиков, а также расширением анализа на эмбриональную стадию развития мышей, так как считается, что заселение микробиотой происходит после рождения.

Флуоресцентный имиджинг Aldara-индуцированного псориаза у мышей TNF-2A-Kat

Поскольку репортерные мыши позволили выявить «кожный фенотип» в экспрессии TNF у наивных мышей, возник вопрос об уровне экспрессии этого цитокина в условиях экспериментального воспаления кожи, такого как псориаз. При проведении сравнительного флуоресцентного имиджинга Aldara-индуцированного псориаза у мышей TNF-2A-Kat и мышей дикого типа было отмечено, что после серии последовательных нанесений препарата интенсивность сигнала флуоресценции в зоне заболевания у мышей TNF-2A-Kat значительно увеличивалась по сравнению с контрольным сигналом от здорового участка кожи, тогда как при индукции псориаза у мышей дикого типа подобных различий в интенсивности сигнала флуоресценции между участком кожи с псориазом и участком нормальной кожи не наблюдалось.

Флуоресцентный имиджинг in vivo и фотографии мыши TNF-2A-Kat (а) и мыши дикого типа (б) в условиях экспериментального псориаза, вызываемого препаратом AldaraТМ.

Наблюдение флуоресценции кожи мышей in vivo в динамике после нанесения псориаз-индуцирующего препарата AldaraТМ показало, что несмотря на формирование псориатических бляшек на коже, изменения сигнала, регистрируемого с поверхности у мышей дикого типа, не наблюдалось. Для мышей TNF-2A-Kat было характерно увеличение сигнала флуоресценции в зоне предполагаемой патологии начиная с 3-го дня после нанесения препарата по 7й день анализа, что, вероятно, свидетельствует о повышенном уровне продукции TNF. С помощью установки для многофотонной томографии MPTflex (Jenlab, Германия) были полученыin vivo изображения участков кожи TNF-2A-Kat репортерных мышей после 7 дней нанесения препарата, а также наивных TNF-2A-Kat репортерных мышей, не подвергавшихся воздействиям AldaraTM. Проводили сканирование кожи по глубине с получением Z-стеков с шагом 5 мкм. Анализ изображений показал, что у TNF-2A-Kat репортерных мышей после нанесения препарата AldaraТМ наблюдается значительное утолщение рогового слоя эпидермиса и избыточное количество кератиноцитов по сравнению с интактным участком кожи, что является признаками псориаза:

In vivo изображения псориатического участка кожи TNF-2A-Kat репортерной мыши (А) и здорового участка кожи (Б). Глубина слоя указана над изображениями. Красный канал: автофлуоресценция, двухфотонное возбуждение фемтосекундным лазером 750 нм. Зеленый канал: коллаген, генерация второй гармоники. Регистрация флуоресценции в диапазоне 409-660 нм.

СОЗДАНИЕ, ЭКСПРЕССИЯ, ОЧИСТКА И ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ БИСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ НА ОСНОВЕ МИНИ-АНТИТЕЛ А9

Одной из основных научных идей проекта, осуществляемого в лаборатории экспериментальной иммунологии, является новый подход к антицитокиновой терапии, основанный на создании более специфических блокаторов TNF, которые будут избирательно нейтрализовать патогенный TNF из конкретных клеточных источников. Для его осуществления на базе уникальных однодоменных антител мозоленогих (ламы, верблюды) были сконструированы биспецифические анти-TNF белки, которые могут нейтрализовать TNF, экспрессируемый макрофагами.

Схема генетических конструкций, кодирующих антитело, связывающееся с TNF и макрофагальным маркером F4/80

Экспрессию белков проводили в бактериальной системе (E. coli, штамм Rosetta 2(DE3)pLysS). Очистка осуществлялась с помощью жидкостной аффинной хроматографии на колонках с Ni-NTA Agarose смолой. Затем, для переведения в HEPES-буфер, проводили 3 раунда диализа. Присутствие и концентрацию белка в элюате оценивали по изменению оптической плотности раствора при длине волны 280 нм, с помощью спектрофотометра при 320-340 нм в реакции с трихлоруксусной кислотой, а также методом электрофореза в ПААГ. Для обеспечения стабильности препаратов белков BV1, BV1c и BV1mut были использованы различные химические стабилизаторы, которые согласно нормативам Федерального закона «О лекарственных средствах» являются безопасными в производстве и применении терапевтических препаратов. Максимальная стабильность белков наблюдалась при присутствии в растворе 10% D(+)глюкозы или D(+)сорбитола. Кроме того, добавление к раствору белков 50 мM аргинина и 50 мM глутаминовой кислоты увеличивало их растворимость. Для предотвращения образования спонтанных внутри- и межмолекулярных S-S связей в раствор была введена окислительно-восстановительная пара 25mM L-аскорбиновая кислота/20 mcM CuSO4. Для определения эффективности связывания белков с TNF был использован метод ИФА, который основан на «сэндвич» – гибридизации. Максимальная чувствительность полученных препаратов антител составила около 5 нг/мл рекомбинантного TNF, что свидетельствует о высокой эффективности взаимодействия BV1, BV1c и BV1mut с белком-«мишенью».

Препараты белков BV1, BV1c и BV1mut после очистки и оптимизации стабильности.

Оценку способности полученными рекомбинантными антителами блокировать TNF проводили с помощью цитотоксического MTT-теста на клетках линии WEHI-164. По результатам теста все три белка обладали ингибирующей активностью по отношению к TNF, и, в концентрации около 100 нМ, полностью блокировали действие TNF, тем самым сохраняя 100% выживаемость клеток.

Кривые выживаемости клеток линии WEHI-164 после взаимодействия с TNF в концентрации 200ЕД и белков BV1, BV1-c, BV1-mut в разных концентрациях. Данные обрабатывались в программе GraphPadPrism с помощью метода наименьших квадратов. Показаны 95% доверительные интервалы.

Исследование BV-1 in vivo на примере модели острой гепатотоксичности, индуцированной введением липополисахарида (ЛПС) и D-галактозамина.

Кривые и диаграмма выживаемости “гуманизированных” мышей в модели острой гепатотоксичности, индуцированной введением липополисахарида и D-галактозамина.

Источник