что такое лимфоцитарный белок
Что такое лимфоцитарный белок
Тест предназначен для оценки Т-клеточного иммунитета к СOVID-19. Позволяет выявить в крови специфические Т-клетки (Т-лимфоциты), реагирующие на определенные антигены коронавируса SARS-CoV-2. Такие специфические Т-лимфоциты способны узнавать и уничтожать пораженные вирусом клетки и могут потенциально обеспечивать долгосрочную защиту от COVID-19, в том числе при отсутствии антител. Оценка Т-клеточного иммунитета наряду с гуморальным (определение антител) может использоваться как дополнительный маркер иммунной защиты от COVID-19.
Используется технология ELISPOT, которая является наиболее перспективной на сегодняшний день платформой для оценки Т-клеточного иммунитета.
Синонимы русские
Т-клети, Т-лимфоциты к коронавирусу.
Синонимы английские
T-cell immunity to COVID-19.
Прямая оценка функции Т-клеток ELISPOT.
Какой биоматериал можно использовать для исследования?
Как правильно подготовиться к исследованию?
Специальной подготовки не требуется.
Общая информация об исследовании
Пандемия SARS-CoV-2 привела к гибели более 2 миллионов человек на сегодняшний день, и существует острая потребность в эффективной вакцине. Есть значительный интерес к пониманию того, насколько адаптивные иммунные реакции контролируют острую инфекцию и обеспечивают защиту от повторного заражения.
Антительные ответы против SARS-CoV-2 характеризуются реакцией против ряда вирусных белков, включая спайковые белки, нуклеопротеины и мембранные белки. Уровни антител снижаются после избавления от первичной инфекции, и в настоящее время актуален вопрос о поддержании гуморальных ответов в долгосрочной перспективе. Хотя первоначальные анализы показали потерю выявляемых вирус-специфических антител у части людей, высокочувствительный ИФА может определять обнаруживаемые антитела в течение как минимум 6-7 месяцев у большинства людей. Данные, полученные в результате исследования иммунитета к родственным вирусам, таким как SARS-CoV-1 и ближневосточный респираторный синдром, свидетельствуют о том, что клеточные иммунные ответы против этих вирусов поддерживаются в течение более длительных периодов по сравнению с ответами антител. Это позволяет надеяться, что клеточные реакции на SARS-CoV-2 также будут более продолжительными. На сегодняшний день исследования показали, что вирус-специфические клеточные реакции развиваются практически у всех пациентов с подтвержденной инфекцией SARS-CoV-2.
Величина и качество ответа иммунной памяти к SARS-CoV-2 будет иметь решающее значение для предотвращения повторного заражения.
Величина ответа Т-клеток является неоднородной и может отражать разнообразие профиля Т-клеточного иммунитета во время острого инфекционного заболевания. Важной особенностью является то, что величина клеточного иммунитета по данным ELISPOT на 50 % выше у доноров, перенесших симптомную инфекцию. Это демонстрирует, что первоначальная «контрольная точка» клеточного иммунитета, выработанная после острой инфекции, сохраняется не менее 6 месяцев. Клеточные ответы имеют прямую защитную способность от тяжелой коронавирусной инфекции, а также поддерживают выработку антител.
Исследования показывают, что устойчивый клеточный иммунитет против SARS-CoV-2 может присутствовать в подавляющем большинстве случаев у взрослых через 6 месяцев после бессимптомной инфекции или легкой и средней степени тяжести инфекционного заболевания. Эти особенности обнадеживают в отношении длительности клеточного иммунитета против этого нового вируса и, вероятно, способствуют относительно низкому риску повторного заражения.
Анализ на Т-клеточный иммунитет проводится методом ELISPOT, который имеет ряд преимуществ:
проверенная технология обнаружения активных Т-клеток для измерения силы иммунного ответа на инфекцию;
технология ELISPOT в настоящее время является уникальной в мире;
ELISPOT широко используется исследователями разных стран при разработке вакцин от COVID-19;
ELISPOT является наиболее перспективной платформой среди методов оценки Т-клеточного иммунного ответа:
к определенным Т-лимфоцитам добавляют белки вируса;
если Т-лимфоциты и вирусы раньше встречались, то они выделяют цитокины;
если спотов больше 12 – это означает, что иммунитет есть.
Для чего используется исследование?
Когда назначается исследование?
Что означают результаты?
Панель антигенов 1 (пептиды белка S), SPOT:
Панель антигенов 2 (пептиды белков N, M, O3, O7), SPOT:
положительный результат может потенциально свидетельствовать о перенесенной или текущей инфекции COVID-19, в том числе бессимптомно, и о сформировавшемся Т-клеточном иммунном ответе к вирусу SARS-CoV-2.
У большинства переболевших, у которых не выявляются антитела, есть Т-клеточный ответ. Люди без антител, контактировавшие с больными и не заболевшие, также в большинстве своем имеют Т-лимфоциты.
Кто назначает исследование?
Терапевт, врач общей практики.
Данная страница не существует!
Услуги инфекционной клиники
Диагностика, профилактика и лечение
Фиброэластометрия и УЗ-диагностика молочных желез, щитовидной железы, мошонки, брюшной полости
Биохимия. Анализ крови: общий, клинический. Анализы на витамины, микроэлементы и электролиты. Анализ на ВИЧ-инфекцию, вирусные гепатиты, бактерии, грибки и паразиты
Максимально точное определение выраженности фиброза печени неинвазивным методом при помощи аппарата FibroScan 502 TOUCH
Гинеколог в H-Сlinic решает широчайший спектр задач в области женского здоровья. Это специалист, которому вы можете полностью доверять
Дерматовенерология в H-Сlinic — это самые современные и эффективные алгоритмы диагностики и лечения заболеваний, передающихся половым путем, грибковых и вирусных поражений, а также удаление доброкачественных невусов, бородавок, кондилом и папиллом
Возможности вакцинопрофилактики гораздо шире Национального календаря прививок. H-Clinic предлагает разработку плана вакцинации и современные высококачественные вакцины в наличии
Терапевт в H-Сlinic эффективно решает задачи по лечению заболеваний, которые зачастую могут становиться большой проблемой при наличии хронического инфекционного заболевания
Врач-кардиолог H-Сlinic проведет комплексную диагностику сердечно-сосудистой системы и при необходимости назначит эффективное терапию. Сердечно-сосудистые проблемы при инфекционных заболеваниях, требуют специфичных подходов, которые мы в состоянии обеспечить
Наша цель — новое качество вашей жизни. Мы используем современные диагностические алгоритмы и строго следуем наиболее эффективным протоколам лечения.
Общая терапия, Инфекционные заболевания, Гастроэнтерология, Дерматовенерология, Гинекология, Вакцинация, УЗИ и фиброэластометрия, Кардиология, Неврология
Биохимия, Общий/клинический анализ крови, Витамины и микроэлементы/электролиты крови, ВИЧ-инфекция, Вирусные гепатиты, Другие инфекции, бактерии, грибки и паразиты, Комплексы и пакеты анализов со скидкой
В наличии и под заказ качественные бюджетные решения и препараты лидер ов рынка лечения инфекционных болезней. Аптека H-Clinic готова гибко реагировать на запросы наших клиентов. Мы поможем с оперативным поиском препаратов, которые обычно отсутствуют в сетях.
Расшифровка лейкоцитарной формулы крови в анализе
Зачем нужна лейкоцитарная формула крови?
Лейкоцитарная формула представляет собой процентное соотношение лейкоцитов в сыворотке крови (эозинофилов, нейтрофилов, лимфоцитов, базофилов, моноцитов). Этот анализ позволяет определить текущее состояние иммунной системы, выявить воспалительные процессы в организме пациента и определить этиологию аллергии.
Известно, что лейкоциты защищают организм человека от опасных микроорганизмов. Одна из главных задач лейкоцитов — разрушение инородных частиц. Если в организме пациента происходит воспалительный процесс, он сразу же отражается на формуле лейкоцитов.
При изменении показателей лейкоцитов в крови необходимо определить, в какую сторону происходит отклонение. Данное исследование поможет быстрее найти проблему и поставить диагноз. Однако следует принять во внимание, что изменения в показателях крови без углубленной диагностики не являются характерным и конечным признаком для постановки диагноза.
Когда назначают анализ?
Клинический анализ крови с лейкоцитарной формулой показан пациентам с различными патологиями. Он позволяет оценить состояние здоровья человека при комплексной и своевременной диагностике заболеваний, в том числе протекающих в скрытой форме.
Показаниями к клиническому анализу крови с лейкоцитарной формулой являются:
Перед сдачей капиллярной крови рекомендуется не употреблять алкоголь в течение дня, не есть в течение 2–3 часов, не курить в течение 30 минут и избегать стрессов и чрезмерных физических нагрузок.
Что такое лейкоциты?
Лейкоциты — это клетки, которые в очень больших количествах содержатся в крови и почти во всех тканях. Их основная функция — защитная и иммунная. Однако они не смогли бы в полной мере выполнять эти функции, если бы не были разделены на несколько разновидностей внутри своей группы, каждая из которых играет свою особую роль.
Основных разновидностей лейкоцитов в крови пять. Они определяются в анализах в виде лейкоцитарной формулы, поэтому уровень лейкоцитов в крови оценивается не только в целом. Всегда подсчитывается еще и содержание этих клеток. К ним относятся:
У них разные функции, но они работают вместе, влияют друг на друга, передают информацию между собой и другое. Высокие или низкие лейкоциты в крови, принадлежащие к определенному типу, указывают на различные заболевания, поэтому определение их количества очень важно в медицинской практике.
Норма у беременных женщин
Количество белых кровяных
телец (*109)
Норма у женщин
Количество лейкоцитов (*109)
Норма у мужчин
Количество лейкоцитов (*109)
Норма у детей
Количество лейкоцитов (*109)
с пятого дня жизни
с десятого дня жизни до месяца
от года до пяти лет
Лейкоцитарная формула:
Нейтрофилы
Нейтрофилы происходят из красного костного мозга, они образуются из одной стволовой клетки, которая является предком всех форменных элементов крови. Однако стволовые клетки не сразу превращаются в нейтрофилы. Между этими двумя формами есть несколько стадий, несколько промежуточных форм.
Всего существует 6 разновидностей нейтрофилов:
Больше всего в крови последних. Они присутствуют в количестве 40–75 % от общего количества лейкоцитов. Значительно меньше количество палочковидных нейтрофилов, их может быть 1–6 %. Число молодых клеток не достигает 1 %.
Лимфоциты
Норма лимфоцитов составляет 20–40 % всех присутствующих в ней лейкоцитов. Большинство из них образуется в красном костном мозге. Некоторые лимфоциты рождаются в других органах иммунной системы, таких как тимус. В этом случае они происходят из лимфоидной ткани.
Моноциты
Моноциты — это клетки иммунной системы, которые одними из первых реагируют на проникновение агрессоров в организм. Если силы местного иммунитета не смогли сдержать атаку бактерий, грибков или вирусов, то именно моноциты первыми бросаются защищать здоровье.
Моноциты образуются в красном костном мозге и выделяются в кровь. Там они начинают активно функционировать, но это длится недолго, всего 2-3 дня. Затем, используя свою способность двигаться, они выходят за пределы сосудов через специальные небольшие поры между клетками и проникают в ткани. Там моноциты немного меняют свою структуру и превращаются в макрофаги — более эффективные фагоциты.
Эозинофилы
Эозинофилы — это небольшое количество лейкоцитов, которые содержатся в крови и тканях человека. Они являются незаменимым элементом, обуславливающим иммунитет.
Как и другие лейкоциты, они образуются из костного мозга, и их прародителем является одна стволовая клетка. Норма составляет 1–4 %.
В общей сложности эозинофилы живут около 12 дней, но не проводят все это время в кровотоке. После 3-4 дней созревания они попадают в кровоток и остаются там всего 6–12 часов. Затем они переходят в ткани и накапливаются в особенно больших количествах в легких, под слизистой оболочкой пищеварительного тракта, в коже.
Когда количество эозинофилов увеличивается, это состояние называется эозинофилия, а обратное изменение — эозинопения. Как правило, яркие сдвиги являются симптомами заболеваний, но некоторые физиологические колебания их количества возможны в пределах нормы. Например, увеличение и уменьшение эозинофилов может наблюдаться в зависимости от времени суток, ночью их обычно больше всего в крови.
Базофилы
Базофилы — это гранулоциты, которые распределяются в периферической крови. Они вырабатываются в костном мозге и высвобождаются в сыворотку крови, после чего оседают в тканях. Жизненный цикл базофила составляет около 7–12 дней. В норме относительное количество базофилов в крови не должно превышать 1 %.
Лейкоцитарная формула крови: расшифровка результатов
Повышение показателей
Повышение нейтрофилов в крови происходит во время инфекционных заболеваний и во время некоторых специфических состояний пациента. Например, при острых инфекционных заболеваниях, кандидозах, ревматизме, опухолевых процессах, отравлении свинцом или ртутью, во время сахарного диабета. Также на увеличение числа нейтрофилов могут влиять состояния, не связанные с заболеваниями, например: сильные физические нагрузки, стрессовые ситуации, перегрев или переохлаждение.
Увеличение количества лимфоцитов говорит о наличии инфекционного заболевания, патологии крови, отравлении свинцом или мышьяком. Некоторые лекарственные средства могу влиять на увеличение лимфоцитов.
Перенесенное инфекционное заболевание влияет на повышение моноцитов. Моноциты увеличиваются при аутоиммунных заболеваниях, при наличии онкологических заболеваний, во время отравления углеродом и фосфором.
Увеличение эозинофилов происходит в ответ на аллергические реакции, при приеме некоторых антибиотиков, лекарственных средств от туберкулеза и судорожных состояний. Также изменять показатели могут паразитарные инфекции, заболевания кожи и органов дыхания, острое течение инфекционного заболевания.
Базофилы в крови повышаются во время гриппа, ветряной оспы, при туберкулезе, при аллергических реакциях, язвенном колите из-за повышенной чувствительности к любой пище, а также увеличение может указывать на наличие раковых опухолей в организме.
Снижение показателей
При уменьшении числа нейтрофилов врач может предположить наличие у пациента инфекционного заболевания, повышенной чувствительности к лекарственным средствам, анемии и анафилактического шока.
Лимфоциты снижаются в условиях иммунодефицита, острых воспалительных процессов в организме, почечной недостаточности и системной красной волчанки.
Снижение моноцитов происходит во время онкогематологических заболеваний, гнойных инфекций и апластической анемии, применения определенных препаратов и в состоянии сильного шока.
На снижение эозинофилов влияет тяжелая гнойная инфекция и отравление тяжелыми металлами.
Беременность, сильный стресс и период овуляции могут быть естественной причиной снижения базофилов. Патологические причины включают инфекционные заболевания и синдром Кушинга.
Что значит сдвиг лейкоцитарной формулы влево и вправо?
Нейтрофилы формируют антибактериальную и противогрибковую защиту организма, и когда определенный микроб попадает в организм, количество нейтрофилов увеличивается. В этом случае изменяется не только их общее количество, но и количество отдельных форм этих клеток.
Цепочка нейтрофилов, расположенных по созреванию:
Юные — палочкоядерные — сегментоядерные.
Сдвиг формулы влево — это увеличение количества молодых клеток, а сдвиг вправо — это увеличение количества старых клеток.
Причины сдвига лейкоцитарной формулы
В медицинской практике чаще случается сдвиг влево. На это влияет наличие в организме острой бактериальной или грибковой инфекции. Костный мозг мобилизуется для защиты организма и начинает интенсивно вырабатывать нейтрофилы. Они начинают борьбу с инфекцией и погибают в процессе. На смену зрелым клеткам вырабатываются молодые. В определенный момент количество молодых клеток превышает число зрелых.
Повышение сегментоядерных нейтрофилов приводит к смещению лейкоцитарной формулы вправо. Это происходит не только на фоне увеличения, но еще чаще при уменьшении количества лейкоцитов. Этому способствуют длительные хронические инфекции, при которых запасы костного мозга истощаются и молодые формы клеток перестают формироваться. Отравление, облучение, химиотерапия и лучевая терапия, при которых также подавляется костный мозг, могут привести к правильному сдвигу.
Для предотвращения изменения числа лейкоцитов и изменений в лейкоцитарной формуле необходимо следить за своим здоровьем. Для поддержания работы иммунитета стоит заниматься спортом, соблюдать режим труда и отдыха, правильно питаться и избегать стрессовых ситуаций. Также не стоит забывать о прохождении планового осмотра у терапевта.
Иммунная система Часть 8 Анализы
Иммунная система Часть 8 Анализы
Помимо поражения вирусом иммунодефицита человека, вторичный иммунодефицит развивается после объемных оперативных вмешательств, обширных, тяжелых инфекций, на фоне терапии иммуноподавляющими или сильными противовоспалительными препаратами.
Исследования иммунитета помогают в оценке активности и стадии воспалительного, инфекционного и аллергического иммунного ответов, эффективности проводимой терапии. С этой целью они проводятся неоднократно.
Клинический анализ крови с лейкоцитарной формулой
Клинический анализ крови с лейкоцитарной формулой позволяет выявить множество заболеваний. Он отражает состояние гемопоэза – созревания и роста клеток крови в костном мозге. О состоянии иммунной системы говорят уровни белых клеток крови – лейкоцитов и лейкоцитарная формула. Наблюдение за лейкоцитарной формулой в динамике заболевания позволит выявить осложнения, распространение инфекции по организму, реакцию на лечение.
При бактериальных инфекциях можно увидеть повышение лейкоцитов и нейтрофилов с появлением их молодых форм в крови.
При вирусных инфекциях, наоборот, лейкоциты снижаются, а в лейкоцитарной формуле преобладают лимфоциты.
Преобладание тех или иных популяций в лейкоцитарной формуле помогает в диагностике причины воспаления. Например, при определенных инфекциях (например, инфекционный мононуклеоз) нарастают измененные моноциты, а при аллергических и паразитарных заболеваниях – эозинофилы.
Наличие совсем юных клеток (бластов) в крови признак чрезмерной активации костного мозга, а низкий уровень лейкоцитов и нейтрофилов без воспаления – его угнетения.
Лимфоциты, иммунофенотипирование
Выделяют разные популяции лимфоцитов, которые играют ключевую роль в направлении иммунного ответа – клеточный или гуморальный. Определение иммунного фенотипа лимфоцита возможно в специальном исследовании методом проточной цитофлюориметрии. Фенотип лимфоцитов зависит от особых рецепторов на их поверхности – кластеров дифференцировки CD. Наличие того или иного рецептора свидетельствует о принадлежности клетки к определенной популяции лимфоцитов.
Т-лимфоциты (CD3+) общие и их подтипы:
Т- клетки-киллеры (CD3+CD16+CD56+)
Естественные клетки-киллеры (CD3-CD16+CD56+)
Лимфоциты с маркером HLA-DR+
Иммунорегуляторный индекс (Т-хелперы/Т-цитотоксические)
Дополнительно исследуют другие CD маркеры лимфоцитов для определения их активности.
Циркулирующие иммунные комплексы и система комплемента
Антигены связываются специфическими антителами с образованием иммунных комплексов. Последние активируют комплемент, способствуют удалению чужеродных антигенов. Если их слишком много циркулирует в крови, они откладываются в тканях, например почек, кожи, легких. Высокое содержание циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) наблюдается при аутоиммунных, хронических воспалительных и инфекционных заболеваниях. С другой стороны, определение ЦИК в крови неспецифично, не отражает ни причину их нарастания, ни непосредственное влияние на органы.
Снижение уровней ЦИК на фоне лечения говорит о затихании воспалительного процесса и эффективности терапии.
Наиболее распространенными анализами на систему комплемента являются определение ключевых С3 и С4 компонентов. Показаниями для исследования – повторяющие инфекции, ревматические и аутоиммунные заболевания для выявления врожденных дефицитов комплемента, утяжеляющих течение этих болезней.
Исследуют уровни ЦИК, С3-компонент и С4-компонент комплемента.
Иммуноглобулины A, M, G, E
Общие иммуноглобулины – показатели гуморального иммунного ответа. Уровни IgM возрастают в острый период заболевания и при обострении хронической инфекции, IgG – в процессе выздоровления, IgA – в острый период заболевания, сохраняясь дольше IgM, отражают затяжное течение и поражение слизистых оболочек. Повышенные уровни IgE свидетельствуют об аллергическом воспалении.
Общие иммуноглобулины не объясняют причину инфекции, поэтому целесообразно смотреть специфические антитела к конкретным возбудителям. Основные показания для определения общих антител – это подозрение на врожденный иммунодефицит, связанный с гуморальным иммунитетом.
Интерфероновый статус и Интерлейкины
Исследования Интерфероновый статус, Интерлейкин-1бета, Интерлейкин-6, Интерлейкин-8, Интерлейкин-10, Фактор некроза опухоли-альфа и другие определяют уровни цитокинов – специфических маркеров иммунного ответа. Помогают в определении стадии заболевания, врожденных дефектов, онкологических заболеваний, активности воспалительного процесса и осложнений. Как правило, требуют динамического контроля для помощи в оценке клинической ситуации и эффективности лечения.
Фагоцитарная активность
Фагоцитарной активностью обладают нейтрофилы, моноциты-макрофаги и другие клетки. Фагоцитоз – это способность поглощать и переваривать антигены, вплоть до целых клеток. Он определяет возможности врожденного иммунитета и необходим для формирования приобретенного иммунитета. Оценка фагоцитарной активности клеток крови трудоемка и сложна. Используют такие тесты как оценка фагоцитоза бактерий с флюоресцентной меткой, тест по восстановлению нитросинего тетразолия.
Фагоцитарная активность повышается при бактериальных, аутоиммунных, аллергических заболеваниях.
Ее снижение наблюдается при врожденных дефектах фагоцитарной системы, хронических инфекциях.
Иммунограмма – это общее название всех исследований иммунного статуса. И в разных лабораториях включают разное сочетание анализов в зависимости от цели обследования. Для оценки клеточного иммунитета применяют исследование иммунофенотипов лимфоцитов. Для оценки гуморального иммунитета – общие иммуноглобулины, при необходимости дополняя их ЦИК, комплементом и белками острой фазы. Для оценки врожденного иммунитета больше подходят определения цитокинов в крови, фагоцитарная активность.
Диагностика Т-клеточного иммунитета: пандемия как драйвер инновации
Диагностика Т-клеточного иммунитета: пандемия как драйвер инновации
Т-клеточный стартап TScan Therapeutics начал коллаборацию с компанией Qiagen для разработки теста на Т-клеточный иммунитет к COVID-19
Автор
Редакторы
Статья на конкурс «Био/Мол/Текст»: Споры о вакцинах и иммунитете против нового коронавируса кажутся бесконечными! От обсуждения ПЦР-диагностики и тестов на антитела дискуссии постепенно смещаются в сторону стойкости иммунитета: но измерить иммунитет человека по-прежнему сложно. Узнаем о том, как пандемия вдохнула новую жизнь в старую технологию и станет ли диагностика клеточного иммунитета доступной, в статье специалиста по Т-клеткам Софьи Касацкой.
Конкурс «Био/Мол/Текст»-2020/2021
Эта работа заняла второе место в номинации «Академия & бизнес» конкурса «Био/Мол/Текст»-2020/2021.
Генеральный партнер конкурса — ежегодная биотехнологическая конференция BiotechClub, организованная международной инновационной биотехнологической компанией BIOCAD.
Спонсор конкурса — компания SkyGen: передовой дистрибьютор продукции для life science на российском рынке.
Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Вакцинация от коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 — одна из самых горячих тем на границе 2020 и 2021 гг. Не утихают споры о безопасности вакцин, разработанных в сжатые сроки, о принципах производства и об основных принципах иммуногенности. Много спорят и о том, стоит ли добровольно прививаться тем, кто уже успел переболеть COVID-19, или, по крайней мере, подозревает об этом. Достаточно ли привиться один раз, а если вирус будет мутировать, как действовать дальше? Достаточно ли переболеть один раз или стоит бояться заболеть одной и той же инфекцией раз в сезон?
Для того чтобы ответить на эти вопросы и понять историю прошлых болезней, нужно изучить иммунную память (также ее называют иммунологической). Как правило, для проверки иммунной памяти на конкретную инфекцию проверяют наличие антител в плазме крови: ИФА-тест на антитела класса IgG (ИФА — иммуноферментный анализ). В этом тесте подсчитывается количество антител, которые сорбируются (прилипают) к стандартизированным антигенам, то есть молекулам, встречающимся именно у возбудителя данной инфекции и нигде больше. Антитела, в особенности класса IgG, поразительно точно и выборочно контактируют с однажды «выбранной» молекулой: мало где в биологии можно найти более точные и постоянные молекулярные контакты. Тем не менее тест на антитела — по большей части дань историческому процессу, а не «золотой стандарт» тестирования иммунной памяти. Пандемия стремительно изменила многие аспекты нашей жизни — может ли она поменять и то, что мы считаем стандартом в диагностике иммунитета?
Увидеть адаптивный иммунитет
«Биомолекула» неоднократно писала об уникальных механизмах, которые обеспечивают работу этой удивительной регуляторной системы — системы адаптивного иммунитета человека [1–3].
Чтобы увидеть Т-клетки и В-клетки разных типов, иммунологи чаще всего используют проточную цитометрию (FACS) [4]. Например, если мы хотим увидеть клетки памяти, то крепим флуоресцентную метку на молекулу, присутствующую только на поверхности клеток иммунной памяти, и подсчитываем клетки, пролетающие по одной через лазер и детектор флуоресценции.
Так можно узнать процент клеток, выполняющих определенную функцию, например, весь объем клеток памяти в крови на все прошлые инфекции. Теперь усложним задачу и выделим только клетки памяти на конкретную инфекцию — например, интересующий всех SARS-CoV-2, — как это сделать? Мы можем увидеть недавно активированные клетки среди клеток памяти. Лимфоциты из образца крови пациента смешиваются и инкубируются с молекулами, принадлежащими вирусу, чаще всего, — с очищенными белками, нарезанными на фрагменты. Т- и В-клетки, способные узнать и связать вирусный антиген, активируются, станут активированными эффекторными клетками, и мы сможем их различить среди всей иммунной памяти на FACS-анализе. Такие тесты проводятся в качестве дополнительных научных исследований.
Тест требует не только несколько часов на выделение клеток и их активацию вирусными белками либо пептидами, но и время дорогостоящего специалиста по проточной цитометрии, у которого прибор для FACS всегда работает и настроен, а не простаивает. Сочетание сразу двух факторов приводит к тому, что метод далеко не массовый. Можно представить метод рутинным в нескольких ведущих медицинских центрах, но сложно распространить: на порядки сложнее, чем внедрить регулярное ПЦР-тестирование.
Антитела или Т-лимфоциты
В качестве гораздо более дешевого и доступного теста, чем FACS, иммунологи смотрят не на сами клетки, а на то, что иммунные клетки производят [5]. Вспомним рецепторы, которые служат для решения задачи точного, прочного и выборочного связывания вирусных белков-антигенов. Т-клетки держат рецепторы на поверхности, на клеточной мембране. А вот В-лимфоциты свои уникальные рецепторы синтезируют как в мембранной, так и в растворимой форме — эти растворимые В-клеточные рецепторы и есть антитела. Получается, что вместо флуоресцентных меток и В-клеток памяти можно просто измерить концентрацию антител? Вдобавок, учебник иммунологии рассказывает, что В-клетки формируют память с помощью Т-клеток. Значит ли это, что если антитела есть, то уже произошло формирование памяти: сначала на уровне Т-клеток, затем на уровне В-клеток?
Да, текущие представления об иммунологии человека говорят: высокий уровень антител подразумевает, что Т-клеточный иммунный ответ тоже есть. Тем не менее известны и неклассические механизмы, при которых В-клетки быстро начинают производить антитела (чаще классов IgD, IgM) вне особых зон лимфоузла и при меньшем контроле со стороны Т-клеток. Обратная логика оказывается неверной: Т-клеточная иммунная память не зависит от наличия антител в крови, формируется независимо и сохраняется дольше.
Интуитивно кажется, что было бы отлично сохранять в крови антитела к коронавирусу после вакцинации или инфекции на всю жизнь. Некоторые инфекции формируют такой иммунный ответ, и это коррелирует с иммунной защитой, то есть вероятностью не заболеть при повторном заражении [6]. Но для других инфекций уровень антител в крови достаточно быстро, за несколько месяцев, снижается. Так происходит потому, что за свою жизнь человек встречает сотни тысяч типов вирусов, и производить антитела на все вирусные антигены просто невозможно. Приходится выбирать, происходит конкуренция с защитой от других инфекций, а также конкуренция с антителами, которые нужны для регуляции собственной физиологии организма. Антитела постепенно снижают концентрацию и пропадают из крови, но сохраняются В-клетки памяти, которые смогут вновь производить нужные антитела при необходимости.
Было бы идеально, чтобы организм производил антитела и держал их в оптимальной концентрации в крови не во время повторной болезни, а чуть заранее: до заражения. Именно для этого существуют сезонные ревакцинации: небольшая бустерная доза антигена поступает заранее и через 9–14 дней иммунитет снова подготовлен к сезонному контакту с большим количеством вирусных частиц вокруг. А постоянное, круглогодичное производство антител на высоком уровне можно оставить тем В-лимфоцитам, которые действительно каждый день сталкиваются с одними и теми же бактериями и вирусами: например, В-лимфоцитам слизистой ЖКТ, работающим с кишечными симбионтами.
ELISPOT: ИФА для Т-клеток?
Антитела оказались удобным для измерения косвенным маркером иммунной памяти, но отсутствие антител еще не говорит об отсутствии Т-клеточной памяти. Специфичную иммунную память Т-клеток, к сожалению, нельзя измерить так же легко, по нескольким миллилитрам плазмы крови. Как упоминалось выше, Т-клетки не секретируют свои рецепторы в растворимом виде. Зато Т-лимфоциты, в соответствии со своей ролью дирижеров всего иммунного ответа, вырабатывают множество сигнальных молекул — цитокинов. Цитокины, в большинстве своем, — тоже растворимые молекулы, и их концентрацию можно измерить в объеме (суммарно), либо «подсветить» с помощью флуоресцентных меток сразу при их секреции из специфичных Т-клеток (и увидеть соответствие клетка—сигнал). На этом принципе основан иммуноферментный анализ на клональных отпечатках Т-клеток, или ELISPOT (enzyme-linked immunosorbent spot).
Как правило, Т-хелперы секретируют сигнальные цитокины, чья основная задача — активировать нужную ветвь иммунного ответа, привлечь клетки врожденного иммунитета и подавить конкурирующие сигналы. Среди функций цитокинов — подача сигналов внутри иммунной системы — от Т-клеток и для Т-клеток для уточнения принятия решений. Подобная информация «для внутреннего использования» передается и от Т-хелперов Т-киллерам, и в обратном направлении. Яркий пример такого сигнала — интерферон-гамма: активированные Т-киллеры секретируют IFNγ наравне с Т-хелперами. Массовая выработка интерферона позволяет быстро распространить информацию на уровне всего организма. На основе измерения продукции IFNγ Т-клетками разработан самый надежный из ELISPOT-тестов на антиген-специфичный Т-клеточный ответ [7], [8].
Для ELISPOT живые изолированные Т-клетки периферической крови инкубируются с антигенами, как правило, белковыми либо пептидными. Этот процесс должен имитировать то, как в организме Т-клетки в лимфоузлах узнают антигены и активируются: процесс презентации антигена. Небольшая доля специфичных клеток узнает антигены и производит IFNγ, причем интерферон сразу фиксируется и позже визуализируется в точке секреции. В процессе активации Т-клетки делятся: из одной клетки образуется целый клон антигенспецифичных клеток, все они производят интерферон, и при визуализации «пятно» продукции интерферона растет в диаметре (рис. 1). При ELISPOT сложно точно сказать, сколько антигенспецифичных клонов было изначально в образце до активации, размножения и формирования пятна. Остается неясным, сколько Т-клеток узнают антиген in vivo, но не прореагировали из-за искусственной формы презентации антигена, не похожей на то, как Т-клетки обычно активируются в лимфоузлах. С другой стороны, метод немного проще оптимизировать в лаборатории и проще делать для многих пациентов одновременно, чем более дорогостоящий FACS-анализ; требующиеся приборы и реагенты дешевле.
Рисунок 1. Схема работы теста ELISPOT, определяющего активацию Т-лимфоцитов при взаимодействии с антигенами нового коронавируса SARS-CoV-2
[11], рисунок с изменениями
Поиск коронавирусных Т-клеток. Инновация TScan
ELISPOT используется во всех лабораториях, которые исследуют иммунитет человека. Метод ELISPOT и его модификации на пересекающихся пулах пептидов (наборах фрагментов, на которые нарезается белковый антиген) использовались в исследованиях эффективности вакцин от ВИЧ, и позже медленно распространились на исследования и других вакцин. В диагностических лабораториях метод стал популярен потому, что для более точной диагностики туберкулеза необходимо оценивать Т-клеточный иммунный ответ. Коммерческий тест получил название T-SPOT. Кроме туберкулеза, для других инфекций аналогичная диагностика не применялась — до 2020 года и кризиса, вызванного новой коронавирусной инфекцией SARS-CoV-2. Необходимость широкой диагностики самой инфекции и иммунной памяти к ней подтолкнула одновременно исследователей и производителей диагностических тестов к разработке новых методов и оптимизации старых и привычных. Интерес к быстрому и дешевому измерению Т-клеточной памяти растет параллельно с популярными в медиа опасениями, что у переболевших COVID-19 быстро пропадают антитела в крови.
Очень многие академические коллективы, которые работают на стыке биохимии, иммунологии человека и прикладных биотехнологий, весной 2020 года стали заниматься разработками для борьбы с пандемией, в том числе разрабатывать и налаживать диагностику инфекции. Нельзя не упомянуть пример коллектива Григория Ефимова из НМИЦ гематологии в Москве, активно работающий как над диагностикой Т-клеточного иммунитета к новому коронавирусу на основе FACS, так и в коллаборации по созданию одного из ИФА-тестов для определения антител к антигенам SARS-CoV-2 [9], [10]. Тем не менее вернемся к теме масштабируемого производства быстрых ELISPOT-тестов на Т-клеточный иммунитет: откуда берутся такие разработки, тоже из фундаментальных и клинических академических лабораторий?
Первой ELISPOT-тест на ковид (T-SPOT Discovery SARS-CoV-2 assay) выпустила компания Oxford Immunotec, ранее создавшая одну из самых популярных версий теста на туберкулез [11]. Этот тест использует пул разнообразных антигенов коронавируса и активацию Т-клеток в смеси с другими лейкоцитами периферической крови: иначе говоря, дизайн теста даже несколько упрощен по сравнению с тестом на туберкулез (рис. 1).
Куда более интересную модификацию запустил небольшой биотех-стартап под названием TScan Therapeutics. Этот стартап переориентировался на инфекционную иммунологию во время пандемии. Как и многие другие коллективы, к примеру, BioNTech (разработчик вакцины от коронавируса совместно с Pfizer), до пандемии они занимались онкологией и задачей оптимальной активации противоопухолевого иммунитета.
Осенью 2020 года TScan Therapeutics подписали соглашение о совместной разработке диагностического теста ELISPOT-типа с компанией Qiagen — крупнейшим производителем лабораторных реагентов и универсальных наборов для типовых экспериментов в молекулярной и клеточной биологии [12], [13]. Эта диагностика Т-клеточной памяти во многом отличается от версии Oxford Immunotec, и в первую очередь отличается идеологически: оксфордская компания быстро и практично сделала аналог своего существующего продукта-бестселлера, сохранив всю платформу и протокол метода и изменив только антиген. TScan же демонстрирует почти идеальный инновационный подход: вначале провели исследования Т-клеточного иммунитета, опубликовали выводы в престижном журнале Immunity, затем появилась идея для диагностического теста и, наконец, возможность производства в партнерстве с Qiagen.
Исследование TScan раскрывает детали того, какие молекулы среди белков коронавируса вызывают наибольший «интерес» у Т-клеток человека [14]. Иммунная память Т-киллеров, согласно исследованию, формируется не только и не столько на фрагменты антигена (эпитопы) S-белка коронавируса, на котором сфокусировано большинство вакцин 2020 года [15]. Напротив, эпитопов гораздо больше в нуклеокапсидном основном белке [16]. Далее, специалисты TScan показали отсутствие перекрестного иммунитета: антигены «сезонных» неопасных человеческих коронавирусов формируют память Т-киллеров, но эти Т-киллеры не способны отреагировать на коронавирус SARS-CoV-2. Наоборот, между SARS-CoV-1 (вызвавшим вспышку атипичной пневмонии в 2003 году) и SARS-CoV-2 существует значительная кросс-реактивность Т-клеток (переболевшие атипичной пневмонией могут быть защищены от SARS-CoV-2).
Обнаружение важнейших участков вируса, вызывающих долгую Т-клеточную память — это поиск иммунодоминантных эпитопов. Если активировать Т-клетки именно такими пептидами, можно существенно повысить качество диагностического теста. Уникальные данные TScan позволяют вычесть фон иммунной памяти на родственные и далекие коронавирусы и поднять специфичность диагностики иммунной памяти. При этом используется платформа, сходная с ELISPOT, что позволяет объединять много образцов и делать тест быстрым и широко доступным. Сейчас исследования Т-клеточного иммунитета при коронавирусе проводится либо в рамках научных исследований, либо на коммерческой основе, но точность и интерпретация теста затруднена, клиент получает результат через 1–2 неделю после теста. Партнерство TScan с Qiagen вселяет оптимизм по поводу доступности теста: ведь продукцией этой компанией пользуются буквально в каждой молекулярной и биохимической лаборатории на планете.
Интересна еще одна деталь. Исследователи из TScan брали донорские Т-клетки у доноров с наиболее распространенными в США генотипами других важных иммунных молекул: молекул HLA (молекул главного комплекса гистосовместимости, Human Leukocyte Antigen) подтипов HLA-A*02:01, HLA-A*01:01, HLA-A*03:01, HLA-A*11:01, HLA-A*24:02 и HLA-B*07:02. В зависимости от типа молекул HLA Т-клетки будут распознавать разные эпитопы одного и того же вируса. А поскольку у разных людей максимально вариабельные молекулы HLA, то и иммунный ответ Т-клеток у каждого формируется максимально индивидуально. Именно с этим связаны и сложности/дороговизна изучения Т-клеточного иммунитета, и невозможность «перелить иммунную память» переливанием крови — такой эксперимент может получиться только внутри пары однояйцевых близнецов. С другой стороны, даже в этом огромном разнообразии реакций клеточного иммунитета Т-клетки разных доноров, отвечающие на новый коронавирус, обладают некоторыми общими характеристиками.
Данные об общих параметрах иммунного ответа, которые будут накапливаться в совместных исследованиях TScan/Qiagen, представляют несомненный интерес для оптимизации лечения пациентов и создания методов лечения, таргетно направленного на активный и безопасный Т-клеточный ответ. Здесь проявляется особая черта сильных deeptech-стартапов в области биологии, биоинформатики и биотехнологий: технологическая платформа может быть использована не только для одного применения и быстрого завоевания рынка, а для разных задач, и в процессе, по ходу решения прикладной задачи возникают ценные, качественные и заметные научные открытия. Конечно, новость о сотрудничестве TScan и Qiagen — всего лишь одна из множества историй о биотех-прорывах 2020 года, и легко могла затеряться среди других новостей и инноваций. Но в этой неприметной новости заложен мощный потенциал, способный изменить современные представления о клинической диагностике иммунной памяти.