что такое клонирование генов

Клонирование ДНК

Клонирование ДНК (клонирование генов) — процесс выделения заданной последовательности ДНК и получения многих её копий in vitro. Клонирование ДНК часто применяют для амплификации фрагментов, содержащих гены, а также любые другие последовательности — например, промоторы, некодирующие последовательности, химически синтезированные олигонуклеотиды и случайные участки ДНК.

Содержание

Рестрикция — лигирование

В классических методиках рестрикции и лигирования, клонирование фрагмента ДНК включает четыре стадии: разрезание ДНК эндонуклеазами рестрикции, лигирование ДНК с вектором, трансфекция и последующий скрининг (отбор).

Выделение вставки

Первоначально необходимо выделить участок ДНК для клонирования. Часто препарат ДНК для клонирования получают при помощи полимеразной цепной реакции, а также разрезания ДНК рестриктазами, обработкой ДНК ультразвуком, фракционированием при помощи агарозного электрофореза ДНК. Выделение вставки может быть сделано технологией клонирования шотган, комплементарной ДНК, искусственным химическим синтезом.

Трансформация

После лигирования плазмидой трансформируют бактерии для наращивания. Бактерии далее выращивают на селективной среде для отбора колоний, содержащих встройку. Индивидуальные колонии отбирают и изучают на наличие встройки.

Трансфекция

После лигирования реакционную смесь со встроенным в требуемой ориентации вектором помещают в клетки. В зависимости от типа клеток используют химическую сенситизацию клеток, электропорацию или генные пушки. Для химической сенситизации не требуется специальное оборудование. Электропорацию используют в случае необходимости высокой эффективности трансфекции. Генные пушки применяют в случае растительных клеток и тканей, так как клеточная стенка растений не дает чужеродной ДНК проникать в цитоплазму и ядро.

Отбор

Получают культуры трансфецированных клеток. Так как описанные выше процедуры часто имеют низкую эффективность, требуются способы выявления клеток, содержащих требуемую вставку в правильной ориентации и отделение таких клеток от не содержащих вставки. Современные векторы для клонирования содержат селективные маркеры (как правило, гены устойчивости к антибиотикам) которые дают возможность расти только клеткам с правильной вставкой расти на селективной среде (с антибиотиком). Векторы для клонирования также часто содержат маркеры, обуславливающие окраску колоний, например при выращивании на среде, содержащей X-gal. Для точного подтверждения успешного клонирования, требуется проверка при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) или секвенирования ДНК.

Генная терапия

Генная терапия подразумевает введение работающего гена в клетки, в которых он отсутствует, что приводит к излечению болезни, связанной с отсутствием или неправильным функционированием гена. Генную терапию классифицируют на две категории. В первом случае мутации содержатся в стволовых или половых клетках, тогда весь организм и все потомки имеют дефект. Во втором случае мутация возникает в соматических клетках, возможна пересадка модифицированных клеток или тканей. Клинические испытания генной терапии соматическими клетками начались в конце 1990-х, для лечения рака крови, печени и легких.

Источник

Клонирование. Просто о сложном

Автор

Редакторы

Статья на конкурс «био/мол/текст»: 27 февраля 1997 года журнал Nature опубликовал статью эмбриолога и генетика Йэна Уилмата и его коллег об успешном клонировании овечки Долли. С этого момента не прекращались споры о целесообразности и этичности опытов по клонированию многоклеточных организмов. В том числе обсуждались вопросы клонирования человека.

Конкурс «био/мол/текст»-2019

Эта работа опубликована в номинации «Школьная» конкурса «био/мол/текст»-2019.

Генеральный спонсор конкурса и партнер номинации «Сколтех» — Центр наук о жизни Сколтеха.

Спонсор конкурса — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.

Спонсором приза зрительских симпатий выступила компания BioVitrum.

Такие слова, как «клонирование» и «клон», могут вызывать различные ассоциации, начиная от фантастических образов одинаковых людей из известного телесериала и, заканчивая историей появления на свет овечки Долли [1]. Но что же такое клон на самом деле?

Клон — группа генетически идентичных организмов или клеток. Если гены идентичны, то, по сути, клоны — одинаковые существа. «Под ударом» оказывается уникальность отдельного многоклеточного организма, в том числе, возможно, и человека [2].

Сегодня существует ряд этических преград для дальнейшего развития клонирования, тем более в отношении человека. Некоторые мировые религии считают клонирование человека недопустимым. В некоторых странах клонирование запрещено вообще. В части стран запрещено клонирование, при котором воспроизводится целый многоклеточный организм [3].

И хотя предметом споров является клонирование многоклеточных организмов, необходимо понять значение термина «клонирование» в широком смысле слова.

Клонирование в биологии — это появление естественным или искусственным путем нескольких генетически идентичных живых организмов. Термин в том же смысле нередко применяют по отношению к одноклеточным организмам и клеткам многоклеточных организмов.

Термин «клонирование» применим как к растениям, так и к животным. Все идентичные организмы, созданные путем клонирования, называют клонами.

Термин «клонирование» можно использовать в двух значениях.

Естественное клонирование

В действительности, клонирование свойственно и растительному, и животному мирам. Например, вегетативное размножение растений, деление бактерий, клональное размножение ящериц. В том числе рождение близнецов у людей — тоже пример естественного клонирования.

Искусственное клонирование

Это группа методов, при которых целенаправленно создаются клоны молекул, клеток, многоклеточных организмов.

Бактериальное клонирование — это целенаправленное создание и выращивание бактериальных клонов для биотехнологий.

Молекулярное клонирование, при котором получают клоны фрагмента ДНК, а затем вставляют в необходимые клетки.

Искусственное клонирование многоклеточных организмов. При этом виде клонирования можно создать клоны клеток, тканей, целого органа или даже организма. Именно искусственное клонирование многоклеточных организмов является предметом споров и разногласий научного сообщества, религии, и предметом этой статьи.

Немного о биологии размножения многоклеточных организмов

Совокупность наследственного материала клетки называется геномом. Многоклеточные организмы — эукариоты. Одной из особенностей эукариотических клеток является то, что наследственный материал находится в ядре клетки в виде хромосом, а также в виде кольцевидной ДНК в митохондриях.

Хромосома — нитевидная структура, состоящая из ДНК и белков. Именно ДНК несет генетическую информацию. Например, в ядре клеток человека содержится 23 пары хромосом (то есть всего 46) [4]. В половых клетках человека содержится половина — 23 хромосомы. При соединении двух половых клеток — маминой и папиной — получается клетка зигота с 46-ю хромосомами (рис. 1). Зигота дает начало всем будущем клеткам и тканям организма. Таким образом, в естественных условиях все клетки многоклеточного организма несут генетическую информацию от своих отца (мужской гаметы) и матери (женской гаметы) [5]. Клетки, содержащие 23 хромосомы, называются гаплоидными, а содержащие все 46 хромосом — диплоидными. В организме млекопитающих все клетки, кроме половых, являются диплоидными соматическими [4], [6].

Рисунок 1. Результат оплодотворения — зигота человека

У разных млекопитающих — разное количество хромосом (см. табл.).

При клонировании нет процесса оплодотворения (слияния) двух половых клеток. У этого многоклеточного организма (клона) не будет отца и матери в общепринятом смысле слова. У него будет один генетический «родитель». Тот, чье ядро использовалось для клонирования.

Немного истории клонирования

У клонирования сложный и тернистый путь.

Можно сказать, что одной из основ клонирования является клеточная теория, разработанная Теодором Шванном в 1839 году. В 1866 году вышла статья Грегора Менделя по селекции растений, в которой впервые говорится о «единице информации». Таким образом были заложены основы генетики. В 1886 году профессор-зоолог Московского университета А.А. Тихомиров обнаружил возможность развития шелковичного червя из неоплодотворенного яйца. В 1892 году Г. Дриш впервые изучил, что происходит с генетическим материалом клетки во время ее деления, на бластомерах морского ежа. Группой ученых также было доказано, что генетическая информация содержится в ядре. В 1902 году два независимых исследователя, У. Саттон и Т. Бовери, описали хромосомы и объявили, что «единицы информации» Менделя находятся в хромосомах. В 1909 году Вильгельм Йоханнсен дал название этим «единицам информации». С этого момента они стали называться генами. В том же 1909 году советский ученый-гистолог А.А. Максимов впервые использовал термин «стволовая клетка» для клетки, которая дает начало другим клеткам. В 1910 году Томас Хант Морган начал определять расположение различных генов в хромосомах мушек. Можно смело сказать, что указанные исследования внесли фундаментальный вклад в развитие всех наук о живом, а также заложили основы клонирования.

В 40-х годах прошлого века советский ученый-эмбриолог Г.В. Лопашов проводил эксперименты по переносу клеточных ядер в энуклеированную (лишенную ядра) яйцеклетку земноводных. Аналогичные работы с земноводными проводили эмбриологи Т. Кинг и Р. Бриггс в США. В 50-х годах английский эмбриолог Д. Гордон пересаживал ядра соматических клеток в яйцеклетки лягушки. В 1963 году Тонг Дизхоу получал клоны карпа. В 1975 году были опубликованы результаты успешной работы Д. Бромхола по клонирования кроликов. В 1983 году Л.А. Слепцова и ее коллеги клонировали костистых рыб (вьюнов). В 80-х годах прошлого столетия ученый С. Вилладсен провел серию успешных опытов по клонированию сельскохозяйственных животных путем переноса в яйцеклетку ядра зародыша. В 1997 году Йэн Уилмат и Кейт Кэмпбелл из Шотландии объявили о прорыве: проведено клонирование овцы с использованием соматической, не зародышевой, клетки [1], [7]!

Долли — самка овцы, первое млекопитающее, которое смогли клонировать из зрелой соматической клетки путем замещения ядра. Технология получения этого клона была следующей.

При клонировании Долли использовали клетки двух «родителей» и «суррогатную мать» — еще одну самку овцы. От одного «родителя» брали яйцеклетку, из которой удаляли ядро. От второго брали ядро, извлеченное из соматической клетки (вымени). Внутрь безъядерной яйцеклетки первой овцы вводили ядро зрелой соматической клетки другой овцы. Затем физическим (электрическим) методом провоцировали процесс деления и образования эмбриона (рис. 2). После чего эмбрион переносили в матку «суррогатной матери» — овцы.

Рисунок 2. Схема клонирования овцы Долли

Потребовалось очень много попыток клонирования, прежде чем на свет появилась Долли. Ученые — биологи из Шотландии Йэн Уилмат и Кейт Кемпбелл — по праву могут считать себя «Родителями» Долли [1]. В 2003 году Долли пришлось усыпить из-за заболевания легких и артрита. После этого ее забальзамированное тело было выставлено в Королевском музее Шотландии.

В вопросе о клонировании остается много сложного и спорного. Необходимо соблюсти все этические нормы по отношению к живому [8]. Но исследования наверняка будут продолжаться. А мы должны понимать, что за словом «клонирование» скрываются не научно-фантастические рассказы, а реальная технология, которая может принести и практическую пользу.

Например, клонирование может помочь получить животных и растения с необходимыми параметрами, такими как плодовитость, устойчивость к болезням. Опыты с клонированием могут помочь в лечении болезней. Очень интересной является перспектива использования клонирования для восстановления популяции вымерших или вымирающих видов. Отдельного внимания заслуживают опыты терапевтического клонирования — получение культуры стволовых клеток для разработки новых методов терапии тяжелых заболеваний, например, онкологических [7].

Источник

КЛОНИРОВАНИЕ

КЛОНИРОВАНИЕ, в биологии – метод получения нескольких идентичных организмов путем бесполого (в том числе вегетативного) размножения. Таким способом на протяжении миллионов лет размножаются в природе многие виды растений и животных. Однако сейчас термин «клонирование» обычно используется в более узком смысле и означает копирование клеток, генов, антител и даже многоклеточных организмов в лабораторных условиях. Появившиеся в результате бесполого размножения экземпляры по определению генетически одинаковы, однако и у них можно наблюдать наследственную изменчивость, обусловленную случайными мутациями или создаваемую искусственно лабораторными методами.

Говоря о клонировании, происходящем в природе или в лаборатории, необходимо представлять себе, что вся генетическая, т.е. наследственная, информация, необходимая для роста, развития, обмена веществ и размножения организмов, передается от родителей потомству в форме дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).
См. также НАСЛЕДСТВЕННОСТЬ; НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ.

ДНК упакована в хромосомах, которых в клетке бывает от одной у некоторых одноклеточных до нескольких десятков у высших растений и животных. Генетического материала, находящегося всего в одной хромосоме крошечного одноклеточного существа вроде амебы, достаточно для осуществления всех его жизненных функций. Однако сложно устроенному животному для этого необходимо примерно 100 000 различных генов.

Прокариоты.

Прокариоты – это самые простые по строению одноклеточные организмы типа бактерий, в клетках которых нет оформленного ядра и многих органелл, свойственных клеткам эукариотов, т.е. эволюционно более продвинутых организмов. Обычно прокариоты размножаются бесполым путем, а именно простым делением клетки надвое. В результате они образуют клоны.
См. также КЛЕТКА; РАЗМНОЖЕНИЕ.

Эукариоты и многоклеточные животные.

Эукариоты характеризуются тем, что их клетки обладают многочисленными органеллами и ядром, в котором заключены хромосомы, т.е. ДНК. Некоторые из этих организмов – одноклеточные, но в большинстве случаев это многоклеточные формы, состоящие из многих различных по структуре и функциям эукариотных клеток. Некоторые простейшие, например амебы и парамеции, способны быстро размножаться путем деления надвое.

У многоклеточных животных произошла специализация клеток и сформировались половые клетки (гаметы), предназначенные для полового размножения. У низкоорганизованных многоклеточных встречается как половое, так и бесполое размножение. С усложнением и увеличением подвижности животных половое размножение стало преобладать. Оно обеспечивает сочетание в потомстве признаков обоих родителей, т.е. исключает образование клонов.

Партеногенез.

Клонирование в природе наблюдается в случае т.н. партеногенеза, когда потомство развивается из неоплодотворенной женской гаметы (яйцеклетки). Этот процесс широко распространен среди насекомых. Поскольку родительская особь всего одна, она генетически идентична потомкам и составляет с ними клон. У млекопитающих партеногенез можно искусственно стимулировать, но эмбрион погибает на ранних стадиях своего развития.
См. также ЯЙЦО; РАЗМНОЖЕНИЕ.

Размножение растений и получение рассады.

У растений известны различные формы бесполого размножения, обычно называемого вегетативным. Самостоятельный организм может развиться у них из частей листьев, стеблей и корней. Если эти части получены от одного растения, то образуется клон. Для вегетативного размножения у многих видов используются специальные структуры, к которым относятся, например, подземные корневища у золотой розги, надземные столоны («усы») у земляники, луковицы у чеснока, клубни у картофеля и клубнелуковицы у гладиолусов. Таким способом размножают не только травянистые, но и многие древесно-кустарниковые виды. К относительно новым методам коммерческого клонирования некоторых растений относится выращивание их из культуры ткани.

Среди сельскохозяйственных культур вегетативно размножают, например, бананы, ананасы, виноград и землянику. Особый способ клонирования, называемый прививкой, применяют в случае плодовых деревьев, в частности пекана, яблони и персика. Черенки, вырезанные из ветвей ценного в хозяйственном отношении экземпляра (привои), приращивают к укорененным растениям (подвоям) того же вида, а иногда и другого – близкого таксономически. Привой нормально растет и приносит плоды, не уступающие по качеству тем, что развиваются на материнском дереве.

Лабораторное клонирование антител.

Все позвоночные для защиты от инфекций вырабатывают особые белки – антитела. Разработаны методы их клонирования, позволяющие получать большие количества идентичных молекул. Произведенные таким образом антитела называются моноклональными. Эти высокоспецифичные вещества используются для определения концентрации ряда белков в жидкостях тела, например белковых гормонов, или для выявления раковых клеток (и возможного воздействия на них), что очень важно в научных исследованиях, а кроме того, является относительно недорогим методом диагностики некоторых заболеваний.

Клонирование генов.

Становится известно все больше специфических генов, связанных с развитием определенных болезней. Эти гены научились выделять из организма и присоединять к ним соответствующие промоторы, т.е. участки ДНК, управляющие их работой. Получаемые генные комплексы можно клонировать несколькими способами. Один из них – полимеразная цепная реакция (ПЦР), т.е. размножение нужного участка ДНК с помощью фермента полимеразы, что позволяет удваивать количество генных копий каждые несколько минут (см. также ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ). Клонированные таким образом гены можно затем ввести в организм животного (получив т.н. трансгенную особь), которое в результате приобретет способность синтезировать нужное вещество, например ценный фармацевтический продукт. Трансгенные животные служат также моделями для изучения ряда тяжелых болезней человека, в частности муковисцидоза.

Клонирование млекопитающих.

Выше уже приводились примеры разных типов клонирования в природе. Если любому зверю порезать кожу, клоны новых клеток быстро приходят на смену поврежденным. Однако клонирование целых высокоорганизованных организмов – процесс гораздо более сложный, чем заживление раны.

Зачем вообще клонировать животных? Во-первых, можно было бы воспроизводить ценные с той или иной точки зрения особи, например чемпионов пород крупного рогатого скота, овец, свиней, скаковых лошадей, собак и т.п. Во-вторых, превращение обычных животных в трансгенных сложно и дорого: клонирование позволило бы получать их копии. Проектируется производить трансгенных млекопитающих, способных синтезировать факторы свертывания человеческой крови и другие жизненно важные для нас продукты и выделять их в составе своего молока. Широкомасштабное развитие такой биотехнологии сэкономило бы огромные количества донорской крови, запасы которой ограничены и могли бы использоваться более эффективно.

Первые опыты.

Первый опыт клонирования земноводных датируется 1952. Впоследствии удалось клонировать также мышей, кроликов, овец, свиней, коров и обезьян. Все успешные эксперименты такого рода начинались с клеток эмбриона, изолируемых на ранних стадиях развития до начала их дифференцировки в т.н. зародышевые листки, дающие начало специализированным тканям и органам. Эти клетки (бластомеры) разделяют, пока их число в зародыше не превысило 32 или 64, и с помощью особых микрохирургических методов помещают по одной в ооциты (неоплодотворенные яйцеклетки), из которых предварительно удаляют ядро. У всех бластомеров одного эмбриона одинаковый набор генов, а ооциты служат для них как бы инкубатором. После соответствующей электрической и/или химической стимуляции и культивирования из этих клеток можно получить идентичные зародыши и перенести их (имплантировать) в матку готовых к зачатию самок того же вида. В конечном итоге такие «приемные матери» родят почти идентичных детенышей, однако вся процедура в целом остается с практической точки зрения крайне неэффективной. Вместо вынашивания всех эмбрионов из первого клона практикуют также их разделение на бластомеры и повторный цикл клонирования, получая в итоге гораздо большее количество пригодных для имплантации зародышей.

Клонирование взрослых млекопитающих.

По мере роста и развития животного соответствующие его гены «включаются» и «выключаются» в строго определенное время, что обеспечивает гармоничное формирование и функционирование всех частей сложного организма. У взрослой особи гены, регулирующие процессы в специализированных (дифференцированных) клетках, должны работать без сбоев, выполняя характерную именно для этой части тела программу: малейшее нарушение здесь чревато болезнью, а то и гибелью всей особи. Следовательно, если вырезать кусочек, скажем, уже сформировавшегося подбородка, нос из него не разовьется. Правда, клетки могут терять специализацию (дедифференцироваться), что наблюдается при возникновении раковых опухолей. Таким образом, клонирование животных из их взрослых клеток путем перепрограммирования последних на нормальное эмбриональное развитие представляет собой хотя и выполнимую теоретически, но крайне сложную задачу, которую многие специалисты считали неразрешимой.

В 1997 шотландский эмбриолог Ян Уилмат со своими сотрудниками сообщил об успешном клонировании ягненка из дифференцированной клетки молочной железы шестилетней овцы. Культивируя клетки этого типа на т.н. минимальной (содержащей лишь минимум необходимых для поддержания жизни веществ) питательной среде, не позволявшей им выполнять свои «взрослые» функции, удалось добиться их дедифференцировки до эмбрионального состояния. Затем такую клетку слили с энуклеированной (лишенной ядра) яйцеклеткой другой овцы и имплантировали начавший развитие эмбрион в матку третьей самки. В результате исходная клетка молочной железы повторила и самостоятельно отрегулировала все этапы, которые в норме проходит оплодотворенное яйцо, превращаясь во многие миллиарды специализированных клеток взрослого млекопитающего. Через некоторое время эти исследователи сообщили о клонировании овцы с введенным в нее человеческим геном, а специалисты из США заявили о создании клонов взрослых коров.

Важно подчеркнуть, что особи получаемых описанным способом клонов не достигают того уровня идентичности друг другу, который свойствен однояйцовым близнецам. Во-первых, развитие их происходит в разных ооцитах, каждый из которых сохраняет некоторое количество собственной ДНК в митохондриях (органеллах дыхания). Во-вторых, эмбрионы вынашиваются различными «приемными матерями», и, наконец, после рождения каждый детеныш попадает в условия среды, неизбежно являющиеся в той или иной степени уникальными.

Открывающиеся перспективы.

Работы Уилмата и других биологов служат основой для новых исследований, которые могли бы значительно расширить наши представления о функционировании генов в ходе нормального развития, а также при воздействии на них ряда лекарственных веществ и стрессовых факторов. Это позволило бы усовершенствовать медицинское обслуживание путем создания и применения новых недорогих инструментов ранней диагностики и лечения. Если бы таким путем удалось разработать методы генной терапии, т.е. «исправления» аномальных генов, ответственных за опасные для жизни врожденные нарушения, человечество смогло бы избавиться от некоторых наследственных заболеваний, серьезно снижающих трудоспособность и сокращающих жизнь людей.

О ценности клонирования для создания трансгенных и элитных животных уже говорилось. При его широком применении можно было бы накапливать в замороженном виде неограниченные количества эмбрионов и другого материала, сохраняя таким образом ныне существующую «зародышевую плазму» во всем ее разнообразии.

Источник