что такое интроны и экзоны
Интроны против экзонов: в чем сходства и различия?
интроны а также экзоны похожи, потому что они оба являются частью генетического кода клетки, но они отличаются, потому что интроны не кодируют, а экзоны кодируют белки. Это означает, что когда ген исп
Содержание:
интроны а также экзоны похожи, потому что они оба являются частью генетического кода клетки, но они отличаются, потому что интроны не кодируют, а экзоны кодируют белки. Это означает, что когда ген используется для производства белка, интроны отбрасываются, а экзоны используются для синтеза белка.
Когда клетка экспрессирует определенный ген, она копирует кодирующую последовательность ДНК в ядре, чтобы мессенджер РНКили мРНК. МРНК выходит из ядра и выходит в клетку. Затем клетка синтезирует белки в соответствии с кодирующей последовательностью. Белки определяют, какой клеткой она становится и что делает.
Во время этого процесса и интроны, и экзоны, составляющие ген, копируются. Экзон-кодирующие части копируемой ДНК используются для производства белков, но они разделены некодирующая интроны. Процесс сплайсинга удаляет интроны, и мРНК покидает ядро только с экзонными сегментами РНК.
Даже при том, что интроны были отброшены, и экзоны и интроны играют роль в производстве белков.
Сходства: интроны и экзоны содержат генетический код, основанный на нуклеиновых кислотах
экзоны лежат в основе кодирования ДНК клетки с использованием нуклеиновых кислот. Они обнаружены во всех живых клетках и образуют основу для кодирующих последовательностей, лежащих в основе продукции белка в клетках. интроны являются некодирующими последовательностями нуклеиновых кислот, найденными в эукариоты, которые представляют собой организмы, состоящие из клеток, которые имеют ядро.
В общем, прокариотыкоторые не имеют ядра и имеют только экзоны в своих генах, являются более простыми организмами, чем эукариоты, которые включают как одноклеточные, так и многоклеточные организмы.
Точно так же сложные клетки имеют интроны, в то время как простые клетки не имеют, сложные животные имеют больше интронов, чем простые организмы. Например, фруктовая муха дрозофила имеет только четыре пары хромосом и сравнительно мало интронов, в то время как у человека 23 пары и более интронов. Хотя ясно, какие части человеческого генома используются для кодирования белков, большие сегменты не кодируют и включают интроны.
Различия: экзоны кодируют белки, интроны не делают
Код ДНК состоит из пар азотистых оснований аденин, тимин, цитозин а также гуанин. Основания аденин и тимин образуют пару, как и основания цитозин и гуанин. Четыре возможные пары оснований названы в честь первой буквы основания, которое идет первым: A, C, T и G.
Три пары оснований образуют кодон который кодирует конкретную аминокислоту. Поскольку для каждого из трех кодовых мест есть четыре возможности, существует 4 3 или 64 возможных кодонов. Эти 64 кодона кодируют стартовые и стоп-коды, а также 21 аминокислоту с некоторой избыточностью.
Во время первоначального копирования ДНК в процессе называется транскрипцияи интроны, и экзоны копируются на молекулы пре-мРНК. Интроны удаляются из пре-мРНК путем сплайсинга экзонов. Каждый интерфейс между экзоном и интроном является сайтом сплайсинга.
Сплайсинг РНК происходит с отрывом интронов в месте сплайсинга и формирования петли. Два соседних сегмента экзона могут затем соединиться.
Этот процесс создает зрелые молекулы мРНК, которые покидают ядро и контролируют трансляцию РНК с образованием белков. Интроны отбрасываются, потому что процесс транскрипции направлен на синтез белков, и интроны не содержат никаких соответствующих кодонов.
Интроны и экзоны похожи, потому что они оба имеют дело с синтезом белка
Хотя роль экзонов в экспрессии генов, транскрипции и трансляции в белки очевидна, интроны играют более тонкую роль. Интроны могут влиять на экспрессию генов через их присутствие в начале экзона, и они могут создавать различные белки из одной кодирующей последовательности через альтернативный сплайсинг.
Интроны могут играть ключевую роль в сращивании генетической кодирующей последовательности различными способами. Когда интроны удаляются из пре-мРНК, чтобы позволить образование зрелая мРНКони могут оставить части позади, чтобы создать новые кодирующие последовательности, которые приводят к новым белкам.
Если последовательность сегментов экзона изменяется, другие белки образуются в соответствии с измененными последовательностями кодонов мРНК. Более разнообразная коллекция белков может помочь организмам адаптироваться и выживать.
Доказательством роли интронов в создании эволюционного преимущества является их выживание на различных этапах эволюции в сложные организмы. Например, согласно статье 2015 года в «Геномике и информатике», интроны могут быть источником новых генов, а посредством альтернативного сплайсинга интроны могут генерировать вариации существующих белков.
Экзоны, Интроны, Сплайсинг
Большинство генов эукариот имеют внутри своей белок-кодирующей части некодирующие вставки – интроны. Экзонами называются куски кодирующей части гена, разделенные интронами. В ходе транскрипции «считывается» все вместе: и экзоны, и интроны. Получается «незрелая матричная РНК». Затем в ходе сплайсинга из незрелой матричной РНК интроны вырезаются, и получается «зрелая матричная РНК», с которой уже можно синтезировать белок. Иногда вместе с интронами удаляются и некоторые экзоны, разные в разных случаях. За счет этого на основе одного гена может быть синтезировано несколько разных зрелых мРНК (с разными наборами экзонов) и, соответственно, будет синтезировано несколько разных белков. Это явление называют «альтернативным сплайсингом».
Транскрипция(= «считывание» гена, «экспрессия»)
Синтез мРНК (незрелой) на матрице ДНК. Фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза. Расплетает и синтезирует. От того, какие ТФ присоединятся или не присоединятся к энхансерам (и к промотору) зависит, с какой вероятностью (частотой) будет транскрибироваться ген (=с какой интенсивностью он будет работать или «экспрессироваться).
Блуждающие гены внутри нас
Когда в 2000 году в ходе одного из самых амбициозных научных проектов было расшифровано около 90% генома человека, многим ученым показалось, что теперь все тайны нашего организма будут окончательно разгаданы. Но очень скоро головокружение от успехов сменилось большим недоумением. Как оказалось, почти полная расшифровка генома не только не помогла генетикам ответить на старые вопросы, накопившиеся к тому времени, но и добавила множество новых.
Английский генетик Джон Бердон Холдейн как-то остроумно заметил: «Мир не просто удивительнее, чем мы себе представляем, — он удивительнее, чем мы можем себе представить». Что бы вы подумали о человеке, который бы вдруг заявил, что внутри наших клеток некоторые участки генома прыгают по спирали ДНК, словно блохи по воротнику бродяги? Что у него чересчур разыгралась фантазия?
Немало подобных критических замечаний пришлось выслушать американскому ученому-генетику Барбаре Макклинток, которая первой объявила научному сообществу о существовании подвижных генов. В конце 1940-х, изучая геном кукурузы, она обнаружила, что на активность генов могут действовать какие-то неведомые элементы, способные, по ее предположению, перемещаться по ДНК. Эта новая гипотеза была настолько революционной, что коллеги-генетики встретили ее, по воспоминаниям самой Макклинток, полным непониманием и «каменным молчанием».
Понадобилось почти четыре десятилетия, чтобы ее новаторские идеи получили полное признание. Как метко заметил российский физик, нобелевский лауреат В. Л. Гинзбург, ученый обязан быть долгожителем, если хочет дождаться признания своих работ. В 1983 году Нобелевский комитет вручил 80-летней Макклинток премию по физиологии и медицине «за открытие мобильных генетических элементов». В своей нобелевской речи она произнесла такие слова: «Геном является высокочувствительным органом клетки, который способен в условиях стресса инициировать собственную реструктуризацию и обновление».
По-настоящему мобильные элементы генома (они же транспозоны, или «прыгающие гены») были открыты через три десятилетия после их теоретического предсказания, в 1970-х. Вначале П. Штарлингер и Д. Шапиро обнаружили простейшие мобильные элементы, названные инсерционными (вставочными), у бактерий. Была установлена их способность вызывать мутации у простейших организмов. Выяснилось, что таких инсерционных элементов в бактериальном геноме может быть от нескольких штук до нескольких сотен. К примеру, у дизентерийной бактерии Shigella dysenteriae на сегодня известно целых 200 копий мобильных элементов. Изучение подвижных генов бактерий имеет большое практическое значение, так как с ними непосредственно связана способность бактерий приобретать устойчивость к антибиотикам.
После бактерий мобильные элементы были обнаружены в сложных организмах. В 1976 году группа советских генетиков, В. А. Гвоздев и его коллеги, смогли найти их у дрозофилы. Уже много лет спустя выяснится, что эти элементы у плодовых мушек в своем роде уникальны. Они исполняют у них функции теломеразы — фермента, наращивающего укорачивающиеся при каждом делении клетки концы ДНК (теломеры). Также обнаружится, что эти элементы имеют большое сходство в строении с человеческими ретровирусами, среди которых самый известный — вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).
Загадочный геном
Экзон — участок гена, несущий информацию о строении белка.
CpG-островки — участки компактного расположения нуклеотидной пары цитозин-гуанин.
Интрон — часть гена, не содержащая информации об аминокислотной последовательности.
Сателлиты — последовательности нуклеотидов, представляют собой очень длинные (в несколько сотен тысяч пар нуклеотидов) участки ДНК с тандемно («голова к хвосту») повторяющимися короткими блоками из 5−200 пар нуклеотидов.
LTR-ретротранспозоны — мобильные ретроэлементы с длинными концевыми повторами (long terminal repeats).
SINE — короткие перемежающиеся ретроэлементы (short interspersed elements).
LINE — длинные перемежающиеся ретроэлементы (long interspersed elements).
Теперь, после изучения простейших организмов и дрозофилы, настала очередь найти «прыгающие» гены у позвоночных, в том числе и у человека, что и было в скором времени сделано. Стало ясно, что мобильные элементы генома чрезвычайно распространены в живой природе. В настоящее время они обнаружены во всех живых организмах, которые только попались под руку ученым, — от бактерий до млекопитающих. У человека на их долю приходится огромная часть последовательности ДНК — более 40%.
Некоторые из мобильных генов, словно домашние любимцы, получили от своих первооткрывателей имена: Магеллан, Аттила, Пенелопа, Турист, Чарли, Спящая Красавица, Эмигрант, Аврора (этот «бывший» — потерявший подвижность — транспозон был открыт российскими учеными и назван так в честь легендарного крейсера).
Наследство от вирусов
На долю транспозонов приходится около 3% всей последовательности человеческой ДНК. И обнаружение новых подвижных генов этого класса продолжается. Так, несколько лет назад российским генетиком Владимиром Капитоновым и его коллегами были открыты еще несколько видов мобильных элементов: Harbinger, Helitron и Polinton. Как выяснилось, они имеют большое сходство с некоторыми вирусами и с подвижными генами бактерий.
Вырезать и вставить
Сегодня все подвижные элементы генома у высших организмов принято делить на два больших класса: ДНК-транспозоны (или просто транспозоны) и ретротранспозоны. Такое деление возникло из-за разных молекулярных механизмов, при помощи которых эти элементы перемещаются по ДНК. В статье мы сможем рассмотреть лишь первый класс мобильных элементов.
ДНК-транспозоны используют для своих перемещений механизм, который получил в научной литературе определение cut and paste (вырезать и вставить). После получения определенного сигнала извне происходит активация гена, ответственного за синтез специального фермента, транспозазы. Этот ген находится внутри транспозона, составляя его важнейшую часть. После этого транспозаза, перемещаясь вдоль ДНК, находит на ней свой транспозон по специальным меткам (инвертированным повторам), ограничивающим его с обеих сторон. Найденный транспозон аккуратно вырезается транспозазой и перемещается в другое место, подготовленное для него на ДНК, то есть вставляется в вырезанную заранее брешь.
Ctrl-C или Ctrl-X?
Подвижные элементы генома делятся на два больших класса: ДНК-транспозоны и ретротранспозоны. Первые используют для передвижения принцип «вырезать и вставить», а вторые — «копировать и вставить».
Иногда транспозаза, закодированная в одном транспозоне, перемещает и другие, похожие мобильные элементы, в том числе те, у которых собственный ген транспозазы поврежден. Получается своеобразная взаимопомощь среди мобильных элементов (или, если хотите, паразитирование одних на других). Поражает удивительная сложность и согласованность всех этих процессов, как будто ими управляет какая-то неведомая сила, словно хороший дирижер оркестром. Надо признать, что многое в этих внутренних процессах тяжело поддается пониманию исследователей — настолько они четко организованы, сложны и скоординированы между собой.
И заключительный этап: внедренный транспозон сшивается с ДНК в новом месте. Место, откуда транспозон «выпрыгнул», подвергается процессу репарации (восстановлению целостности ДНК). Или, если «прыжок» произошел во время деления клетки, в пустое место вставляется копия элемента, снятая с сестринской молекулы ДНК. Во втором варианте происходит «размножение» транспозона — в хромосоме становится на один мобильный элемент больше. Такие перемещения несут потенциальную опасность для клетки и всего организма.
Дикие и домашние
Сегодня по приблизительным подсчетам существует около 100 генетических патологий человека, которые вызываются непосредственно мобильными элементами. И этот список продолжает расширяться. Также очевидно, что подвижные гены каким-то образом связаны со старением — с возрастом обнаруживается усиление их деятельности, вызванное ослаблением репрессивных механизмов.
Потенциальную опасность мобильных элементов для живых организмов косвенно подтверждает тот факт, что у нас имеется сразу несколько способов подавления их активности. Это прежде всего метилирование подвижных генов, когда к участку ДНК, где они расположены, присоединяется метильная группа (один атом углерода и три атома водорода — CH3). Метильную группу можно сравнить с «заглушкой»: после ее присоединения к ДНК мобильные элементы не в состоянии проявлять свою активность (подробнее о метилировании читайте в «ПМ» № 2’2015 «Какие возможности дает изменение алфавита ДНК?»).
Также в борьбе с транспозонами живые организмы активно используют механизм РНК-сайленсинга — подавления экспрессии генов подвижных элементов при помощи коротких одноцепочечных РНК. Этот механизм обеспечивают так называемые piwiРНК, действие которых было впервые обнаружено в 2001 году в Институте молекулярной генетики РАН академиком В. А. Гвоздевым, А. А. Аравиным и их коллегами.
Долгое время после открытия считалось, что от подвижных элементов можно ожидать лишь неприятностей — например, приводящих к болезням мутаций при встраивании транспозона в ген, кодирующий белок или РНК или регулирующий их работу. Такой точки зрения придерживались и первооткрыватели структуры ДНК Д. Уотсон и Ф. Крик. Но в последние годы появились данные, что транспозоны могут все-таки «одомашниваться» и превращаться из паразитов в полезные структуры.
НАШ ЭКСПЕРТ:
Владимир Алексеевич Гвоздев, заведующий Отделом молекулярной генетики клетки Института молекулярной генетики РАН, профессор МГУ, академик РАН:
«Как обычно бывает в экспериментальной фундаментальной науке, открытия появляются неожиданно, их нельзя запланировать — ставится одна задача, а в процессе попыток ее решения обнаруживается что-то совсем новое и неожиданное, только не надо проходить мимо. Так, когда-то поставленная Г. П. Георгиевым задача исследовать принципы устройства регуляторной зоны генов у многоклеточных животных привела к открытию перемещающихся элементов генома у плодовой мушки — дрозофилы, замечательного модельного объекта молекулярной генетики. А совсем в других работах в это же время, уже не на дрозофиле, было обнаружено, что гены состоят из отдельных кусочков, кодирующих отрезки РНК, которые затем сшиваются с образованием полноценной РНК, кодирующей белок. Этого никто не мог предсказать, и это открытие было удостоено Нобелевской премии».
Считается, что мобильные элементы из класса транспозонов были активны в период ранней эволюции многоклеточных животных, а у предка человека и обезьян прекратили свои перемещения по геному около 40 млн лет назад. В наследство от этих древних транспозонов человек тоже получил некоторые рабочие гены, в том числе обеспечивающие работу уникального механизма, при помощи которого мы боремся с чужеродными вторжениями в наш организм.
К этому механизму относятся белки RAG — прямые потомки мобильного фермента транспозазы из семейства транспозонов класса transib (элемент, открытый известным «охотником за транспозонами», российским генетиком Владимиром Капитоновым). Причем данный вид транспозонов идентифицирован исключительно в геномах беспозвоночных, которые передали в процессе эволюции свой главный фермент позвоночным, что дало нам возможность синтезировать белки RAG. Именно они, подобно умелому конструктору, собирают из разных структур гены антител, комбинируя фрагменты ДНК в клетках иммунной системы — лимфоцитах.
Вероятно, в процессе эволюции транспозоны не раз выступали в роли активных инструментов мутаций, инициируя своими перемещениями создание генетического разнообразия. Сегодня, после секвенирования генома человека известно около 50 генов, произошедших напрямую от транспозонов.
Так, постепенно, в свете накопленных данных, уходит исключительно негативная оценка деятельности мобильных элементов. Напротив, сегодня многие ученые склонны рассматривать их как «генный резерв» организмов, который те используют для своего развития и противостояния стрессам. Всё, что сегодня связано с мобильными генетическими элементами, активно изучается во многих лабораториях во всем мире, так как, кроме чисто научного интереса, имеет большое прикладное значение — подвижные гены оказались тесно связаны с развитием, старением и многими патологиями.
Глава вторая. Строение эукариотических генов
2.1. Экзоны и интроны
Открытие прерывистой структуры гена 49. Прерывистая структура эукариотических генов и явлений сплайсинга были открыты при детальном изучении структуры генома аденовируса 2, одного из вирусов, содержащих ДНК.
Две группы в лаборатории Колд-Спринг-Харбор (США) изучали структуру поздних мРНК аденовируса и неожиданно обнаружили, что все они начинаются с одной и той же короткой последовательности, т. е. 5′-конец у всех пяти мРНК был одинаковым (см рис. 4). Далее оказалось, что эта последовательность не соседствует с поздними генами, а выявляется в левой части аденовирусного генома на значительном расстоянии от них. Более того, эта «лидерная последовательность» гибридизовалась с тремя разными участками левой половины генома. Особенно четко такая структура мРНК выявляется при изучении гибридов между мРНК и ДНК аденовируса в электронном микроскопе. На электронных микрофотографиях отчетливо видно, что каждая поздняя мРНК аденовируса образует гибриды с четырьмя разными участками аденовирусного генома: тремя короткими, расположенными в его левой части, и одним длинным (собственно геном). В то же время появились данные, что главным первичным продуктом транскрипции аденовирусного генома на поздних стадиях инфекции является длинная РНК, считываемая почти со всей L-цепи.
Учитывая все это, единственным объяснением странной структуры аденовирусных мРНК являлось допущение, что вначале идет непрерывная транскрипция генома, образуется длинный предшественник мРНК (про-мРНК), затем из этой про-мРНК вырезаются внутренние участки, а образовавшиеся концы соединяются, связываются (см. рис. 4).
В 1977 г. этот вывод казался совершенно парадоксальным, не вытекающим из каких-либо теоретических предпосылок. Однако эксперимент был настолько ясен, что он был безоговорочно принят на симпозиуме 1977 г. в Колд-Спринг-Харбор, посвященном хроматину. Стало ясным, что по крайней мере гены аденовируса складываются из нескольких несоседствующих блоков, названных позднее экзонами. Экзоны, в свою очередь, разделены блоками ДНК, не выявляемыми в зрелой мРНК. Последние были названы нитронами.
Новообразующаяся про-мРНК считывается непрерывно и поэтому содержит в своем составе и экзоны и интроны. Затем интроны вырезаются из про-мРНК, а концы экзонов соединяются. Это явление получило название сплайсинга.
Дальнейшее изучение транскрипции и сплайсинга поздних генов аденовируса позволило уточнить детали этого процесса. Транскрипция всегда начинается с первого экзона и кончается после прохождения РНК-полимеразы почти вдоль всего генома аденовируса. Затем в про-мРНК вносится разрыв сразу после одного из пяти генов, что и определяет судьбу про-мРНК. При сплайсинге удаляются интроны между 1-м и 2-м лидер ами, между 2-м и 3-м лидер ами и, наконец, весь отрезок про-мРНК между 3-м лидер ом и началом последнего экзона. Если, скажем, цепь оборвалась после третьего экзона, то экзоны, соответствующие двум первым генам, удаляются, т. е. в этом случае они являются частью большого третьего интрона (см. рис. 4).
Первые результаты были получены на генах β-глобина мыши и овальбумина кур. Оказалось, что фрагменты генома, с которыми гибридизуется мРНК соответствующих генов, в своей сумме намного превышают по размерам длину мРНК. Наиболее информативны данные по сравнению структуры геномного клона, содержащего данный ген, и кДНК-клона, т. е. клона, ДНК которого считана ревертазой с мРНК. В этом случае прямо сравнивается структура гена и мРНК.
Размер интронов иногда составляет всего несколько десятков пар нуклеотидов, а иногда, например в случае ряда генов дрозофилы (D. melanogaster), достигает нескольких десятков тысяч пар нуклеотидов.
Рассмотрим некоторые особенности строения интронов. Одной из характерных черт является консервативность локализации интронов в родственных генах одного вида или в одинаковых генах разных видов. В то же время нуклеотидная последовательность самих интронов мало консервативна и подвергается быстрым изменениям в эволюции. Поэтому интроны, расположенные в одних и тех же местах родственных генов, могут сильно различаться по нуклеотидным последовательностям. Они, во всяком случае, гораздо менее консервативны, чем экзоны.
Теперь мы рассмотрим более подробно экзон-интронную структуру двух генов, клонирование которых было осуществлено в нашей лаборатории.
Так как, по расчетам, мРНК для белка р53 должна была составлять не более 0,01 % от всей мРНК, то тотальную мРНК клеток опухоли SVT2 мыши вначале обогащали по р53-мРНК. Для этого выделяли из клеток мРНК, ультрацентрифугировали ее в сахарозном градиенте, собирали фракции РНК и вели на каждой из них синтез белка in vitro, добавляя в смесь меченую аминокислоту, метионин-[35S]. Из инкубационной смеси осаждали белки антителами к р53 и после электрофореза определяли появление меченого белка, имеющего ту же подвижность, что и р53. Фракции, которые содержали мРНК, обеспечивающие синтез р53, собирали и использовали для синтеза на них комплементарной ДНК (кДНК) с помощью фермента ревертазы (см. разд. 1.7). Синтезированную двухцепочечную ДНК встраивали в плазмиду и клонировали. Затем проводили поиск колоний, содержащих ДНК гена р53. С этой целью из клона выделяли ДНК и на эту ДНК вылавливали соответствующую ей мРНК путем гибридизации. Далее, на отловленной мРНК синтезировали меченый белок и определяли его природу с помощью антител к белку р53, как описано выше. Из примерно 100 проверенных таким образом клонов был получен один, содержащий ДНК, которая связывала мРНК для белка р53. Используя меченую ДНК полученного клона как зонд для гибридизации, вели поиск других клонов, содержащих другие части гена р53 мыши. Для этого вели гибридизацию меченой ДНК прямо с колониями бактерий, перенесенными и выращенными на фильтре (см. разд. 1.7). В результате было поймано еще несколько клонов и входящие в них вставки вместе перекрыли почти всю мРНК для гена р53. Так было осуществлено клонирование полной кДНК, или экзонной части гена р53. Вскоре после этого клонирование гена р53 было осуществлено и рядом других авторов.
Чтобы выделить геномный клон р53, использовали «библиотеки» клонированных фрагментов тотальной ДНК мыши или человека. ДНК фрагментировали рестриктазами и встраивали в бактериофаг X, которым затем заражали бактерии. Образовывалось множество бляшек. С ними гибридизовали ДНК ранее полученных клонов и таким образом находили колонии фагов, содержащие ген р53. В результате были изолированы полные геномные копии гена р53 мыши и человека. Сравнение между собою геномных и кДНК клонов позволяет выяснить экзон-интронную структуру гена. Такая работа была проделана почти одновременно в ряде лабораторий, в том числе в нашей В. Л. Бухманом и Н. Н. Нинкиной, которые анализировали ген р53 человека (рис. 6). Видно, что этот ген содержит 11 экзонов и 10 интронов.
18,3 т. п. н., из которых на экзоны приходится ∼2,6 т. п. н. В результате про-мРНК примерно в 7 раз длиннее, чем зрелая IMPHK. Интересно, что ген р53 мыши, хотя и отличается от человеческого по нуклеотидным последовательностям, особенно в интронах, имеет точно такую же организацию. В нем также некодирующий белок экзон отделен очень большим (6,3 т. п. н.) интроном от кластера из 10 кодирующих экзонов. Интроны располагаются в тех же самых местах, что и у гена мыши. Таким образом, общая структура гена весьма консервативна.
Рис. 6. Экзон-интронная структура онкогена р53 человека Экзоны даны широкой линией и буквой Э с номером экзона. Указан первичный транскрипт и зрелая мРНК (по результатам, полученным В. Л. Бухманом, О. П. Самариной и др.)
В ходе клонирования геномных копий было получено два варианта клонов, различающихся между собою по рестриктной карте. Они представляют собою два аллельных варианта гена р53, встречающихся в человеческой популяции. Оба варианта кодируют полноценный белок, хотя даже в аминокислотной последовательности белка имеются небольшие различия.
Клонирование гена и определение его структуры является обычно первым шагом по пути выяснения функционирования гена и регуляции его активности. В случае р53 использование клонированного гена позволило отчасти пробить свет и на функцию самого белка р53. Р. Вайнберг и ряд других ученых в США показали, что при введении этого гена в нормальные клетки и его последующей активной работе (синтезе мРНК и белка) клетки претерпевают ряд изменений, характерных для опухолевых клеток. Они становятся «бессмертными», т. е. приобретают свойство неограниченно размножаться при выращивании вне организма, в культуре клеток. На основе этих опытов ген р53 был отнесен к онкогенам, т. е. генам, изменения в которых могут вести к раковому превращению клеток.
Клонирование гена было осуществлено в нашей лаборатории Г. Н. Ениколоповым в сотрудничестве с Б. И. Кузиным (лаборатория Л. И. Корочкина). Стратегия клонирования была другая, чем в случае гена р53. Она базировалась на знании локализации гена в хромосомах и места экспрессии гена. Во-первых, как отмечалось выше, синтез эстеразы S идет исключительно в семявыносящих луковицах. Предварительные оценки показывали, что до 10 % всего вновь образующегося белка в этом органе составляет эстераза S. Можно было ожидать поэтому, что концентрация мРНК для эстеразы S в семявыносящих луковицах будет очень высокой (не менее 1 %) и поэтому хотя бы один клон из 100, гибридизующихся с мРНК (или синтезированной на ее матрице кДНК), будет содержать нужный ген.
Исходя из этого, вначале получали клоны, содержащие фрагменты геномной ДНК D. virilis. Далее, на мРНК из семявыносящих луковиц синтезировали с помощью ревертазы меченую ДНК и гибридизовали ее с колониями. Те колонии, ДНК которых активно связывала метку, наращивали, выделяли из них ДНК, метили ее и гибридизовали с препаратами политенных хромосом слюнных желез личинок D. virilis.
Однозначное доказательство было получено при инъекции ДНК клона в ядра овоцитов лягушки. Этот тест был впервые введен в практику М. Бирнстилом (Швейцария) для изучения регуляции транскрипции. Введенная в овоцит лягушки чужеродная ДНК становится там матрицей для синтеза мРНК, а на последней в цитоплазме овоцита активно синтезируется белок. Действительно, после введения ДНК клона в ядра овоцитов лягушки в последних начинался активный синтез эстеразы S дрозофилы, которую далее выявляли с помощью иммунологического теста.
Рис. 7. Экзон-интронная структура гена эргеразы S Drosophila virilis. Экзоныьаны жирной линией и обозначены буквой Э с номером (по результатам, полученным Г. Н. Ениколоповым и соавт.)
Имея геномный клон эстеразы S и соответствующую мРНК, Г. Н. Ениколопов сравнил их путем гибридизации мРНК с фрагментами ДНК и тем самым проанализировал экзон-интронную структуру гена, представленную на рис. 7. Из последнего видно, что ген состоит из двух экзонов, разделенных небольшим интроном. Вообще, обычно размеры интронов у насекомых меньше, чем у позвоночных.
С помощью клонированной последовательности была изучена транскрипция гена эстеразы S. Оказалось, что содержание мРНК для эстеразы S в клетках семявыносящих луковиц по крайней мере на три порядка выше, чем в других клетках дрозофилы. Те редкие транскрипты, которые (выявляются в других клетках, начинаются с точек, отличающихся от места старта главного транскрипта семявыносящих луковиц. Таким образом, только в дифференцированных клетках идет активная экспрессия гена эстеразы S.
Почему существуют интроны? 57. Открытие экзонов и интронов дало объяснение первому парадоксу организации генома у эукариот, а именно большим размерам единиц транскрипции, намного превышающим размеры собственно генов. Действительно, на интроны приходятся гораздо больше ДНК, чем на экзоны, и соответственно про-мРНК существенно длиннее, чем зрелая мРНК.
В то же время разорванная структура эукариотических генов была одной из крупнейших неожиданностей в молекулярной биологии. Она не вытекала из каких-либо априорных соображений, а просто явилась неумолимым выводом из результатов эксперимента. Однако, как только она стала совершившимся фактом, начались попытки осмысливания этого явления. Возник вопрос, зачем природе понадобилось вводить сложный процесс сплайсинга, включающего разрывы и соединения концов РНК и уничтожение трех четвертей синтезированной про-мРНК, вместо того чтобы просто иметь непрерывные гены, как в случае прокариотических организмов.
Остановлюсь на ряде высказанных в разное время гипотез. Прежде всего возникла идея, что сплайсинг с его способностью объединять разъединенные отрезки ДНК в один ген может играть важнейшую роль в эволюции, в частности в объединении разных генов в один и, следовательно, разных полипептидных цепей в одну. Тем самым сравнительно легко могут возникать новые гены. Эти представления находят подтверждение при сравнении экзон-интронной структуры некоторых генов и так называемой доменной структуры соответствующих им белков. Ряд белков состоит из нескольких доменов, т. е. блоков, разделенных структурно и функционально. Классическим примером является фермент ДНК-полимераза I. Хотя она и представлена одной непрерывной полипептидной цепочкой, но состоит фактически из двух разных ферментов: собственно ДНК-полимеразы (синтезирующей ДНК) и экзонуклеазы (разрушающей ДНК с конца). Эти два домена образуют две независимые компактные частицы, связанные между собою коротким полипептидным мостиком. Последний легко разрушается при мягкой обработке протеиназами, когда домены остаются неповрежденными в силу своей компактности. Это ведет к разделению доменов.
В эукариотических организмах белков, состоящих из нескольких доменов, очень много. Оказалось, что в тех случаях, когда в составе белка можно различить несколько доменов, то в гене на границе между отрезками, кодирующими соседние домены, как правило, присутствует интрон. Каждый домен, таким образом, представлен одним или несколькими экзонами. Можно допустить, что когда-то домены были разными генами, но затем в результате мутаций на их границах появились сигналы для сплайсинга и в результате произошло их объединение и создание нового гена. Ярким примером являются гены для мембранных белков рецепторов. У этих белков всегда есть по крайней мере четыре домена:
Эти домены в составе гена всегда разделены между собою нитронами.
Много примеров альтернативного сплайсинга получено на аденовирусе, где часто из одной и той же про-мРНК образуются по две, три или четыре разных мРНК, кодирующих разные белки (см. рис. 4). Существенно, что при альтернативном сплайсинге часто происходят изменения рамки считывания, т. е. одна и та же нуклеотидная последовательность дает разные аминокислотные последовательности. Для вирусов это особенно важно, так как позволяет более экономно использовать генетический материал, обеспечивает компактизацию генетической информации у вируса. Поскольку для клеточного генома ограничений по размеру не существует, то там явление альтернативного сплайсинга встречается реже и, как правило, рамка считывания сохраняется неизменной. Для многих генов вообще существует только один возможный вариант сплайсинга, и из одной про-мРНК образуется лишь один тип мРНК. Тем не менее и для генов эукариот можно найти много случаев альтернативного сплайсинга, при котором часто (по крайней мере, в случае вирусов) все варианты реализуются с определенной частотой, прежде всего в зависимости от последовательности нуклеотидов на границе экзона и интрона и от места положения сайта сплайсинга.
Использование того или иного типа сплайсинга не является объектом контроля. Однако в некоторых случаях реализуется и такая возможность. Например, у дрозофилы существует генетический элемент (называемый Р-элементом), кодирующий фермент транспозазу, который катализирует вырезание из генома и обратное встраивание в геном Р-элемента. Ген транспозазы состоит из четырех экзонов и трех интронов. При этом в большинстве клеток дрозофилы из про-мРНК вырезаются только два первых интрона, и полученная в результате мРНК не способна синтезировать транспозазу. Только в зародышевых клетках дрозофилы появляется некий дополнительный фактор, который обеспечивает вырезание третьего интрона. В результате только в этих клетках возникает активная транспозаза, что, в свою очередь, проявляется в вырезании из генома и встраивании в геном Р-элемента. В других клетках таких перемещений Р-элемента по геному выявить не удается.
Если искусственно с помощью генноинженерных методик удалить из гена транспозазы третий интрон и ввести такой Р-элемент в геном дрозофилы, то тогда он меняет свое поведение. Зрелая мРНК, кодирующая транспозазу, появляется во всех типах клеток, и в любых клетках организма становятся возможными перемещения Р-элемента.
Иными словами, на этой системе путем контроля процесса сплайсинга осуществляется регуляция активности гена.
Имеются и другие сходные примеры.
Нарушения экзон-интронной структуры и генетические болезни 2* [59, 60]. Хотя мутации внутри нитронов обычно проходят бесследно, мутации, затрагивающие границу между экзоном и интроном, могут иметь далеко идущие последствия. Огромный материал в этом отношении накоплен для мутаций в β-глобиновом гене, которые ведут к наследственной болезни β-талассемии. Разными исследовательскими группами проклонированы β-глобиновые гены из большого числа пациентов с β-талассемией, при которой нарушается адекватный синтез β-глобина. В тех случаях, когда грубых изменений в организации β-глобинового гена не наблюдалось, был проведен анализ первичной нуклеотидной последовательности. При этом оказалось, что часто при β-талассемии β-глобиновый ген имел единичные нуклеотидные замены как раз в области сочленений между экзонами и интронами. Это ведет к инактивации сайта сплайсинга, т. е. интрон перестает отсекаться от экзона в правильном месте. Обычно, однако, в нуклеотидной последовательности интрона находится другой участок, напоминающий по структуре сочленение. Этот участок и берет на себя функции сайта для сплайсинга. Их называют поэтому скрытыми сайтами сплайсинга. Однако при этом новая мРНК оказывается резко измененной и неспособной обеспечить синтез нормального β-глобина (рис. 9).
Бывают случаи, когда точечные мутации и внутри интрона порождают нарушения в сплайсинге. Это обычно связано с появлением в результате такой мутации последовательности, напоминающей усредненный сайт для сплайсинга. В настоящее время, начиная с классических работ Т. Маниатиса (США), описано много таких мутаций, характерных для талассемий из разных регионов.
При этом оказалось, что дополнительный сигнал, располагающийся в цепи РНК раньше, является значительно более активным, чем истинный сигнал. Поэтому у больного в процессе созревания β-глобиновой мРНК образуются два типа молекул. В 10 % случаев возникают нормальные мРНК- Большая же их часть (до 90 %) является дефектной и образуется за счет использования нового сигнала сплайсинга. Дефектные мРНК быстро разрушаются в клеточном ядре вскоре после своего синтеза. Таким образом, в цитоплазме эритроидных клеток больного имеются лишь нормальные (3-глобиновые мРНК, однако их количество снижено в 10 раз. У больного образуется в 10 раз меньше β-глобинового белка, что резко нарушает нормальную продукцию молекул гемоглобина в целом и приводит к развитию клинических признаков β-талассемии.
Следовательно, мутации, ведущие к нарушению сплайсинга, играют существенную роль в возникновении ряда наследственных болезней человека. Очевидно, что раз они так сильно меняют функциональную организацию гена, то им может принадлежать существенная роль и в процессах создания новых генов в ходе эволюции.