что такое генномодифицированные препараты
Может вызывать рак: чем опасны ГМО
На этой неделе в Москве состоялась презентация уникальной книги «Энциклопедия ГМО: мифы и правда». В ней впервые на русском языке собраны все самые интересные факты о генной инженерии в сельском хозяйстве. Англоязычный вариант издания прочитали уже более полумиллиона человек. Её авторы — британские специалисты, более 20 лет отслеживающие развитие технологии и проблемы, к которым она привела.
Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) определяет генетически модифицированные организмы (ГМО) как «организмы, генетический материал (ДНК) которых был изменён способом, не встречающимся в природе».
Несмотря на то что в последнее время тема использования ГМО в продуктах питания появляется в СМИ всё реже, проблема безопасности такого питания никуда не исчезла. Количество же компонентов продуктов, которые могут содержать ГМО, с каждым годом возрастает.
В России на прилавках в виде добавок к привычным продуктам заменителей молока, различных наполнителей можно встретить уже 27 вариантов трансгенных сои, кукурузы, риса и свёклы. Именно столько так называемых ГМ-линий получили регистрацию в Роспотребнадзоре. Всё это — импортные компоненты, так как с 2016 года на территории России запрещено выращивание ГМ-культур в коммерческих целях. Корм для скота также может содержать ГМО, и количество разрешённых к употреблению таких добавок в России постоянно увеличивается.
В чём опасность ГМО? Умер ли кто-то от их употребления?
Однако «результаты исследований показывают, что ГМ-пищевые продукты могут быть токсичными, аллергенными, и у них могут наблюдаться неожиданные изменения питательных свойств», говорится в книге. Среди отдалённых последствий называют и онкологию.
Краткосрочные эффекты от ГМО для здоровья человека, увы, никто специально не отслеживает. Фото: Кирилл Зыков / АГН «Москва»
«Когда в лаборатории создаётся ГМО, возникает организм с новым набором функций, происходят изменения биохимии растения, это может привести к возникновению новых токсинов или аллергенов. И это не фантазия, это результаты реальных многолетних исследований на животных. Являемся ли мы тоже подопытными кроликами в этом эксперименте? Я хорошо знаю ситуацию в США и могу со стопроцентной уверенностью сказать, что состояние здоровья населения там на очень низком уровне, 50 процентов детей имеют хотя бы одно хроническое заболевание: аллергозы, проблемы пищеварительной системы, различные расстройства поведения. Один из 65 детей страдает аутизмом. Фиксируется и рост онкологических заболеваний у детей. И этот скачок произошёл в последние 20-30 лет. Почему? Одна из причин — плохое качество продуктов питания. Американцы уже давно употребляют продукты с ГМО. Связано ли это именно с ГМО? Никто не изучал. Просто не задавался таким вопросом», — комментирует Майкл Антонио, автор труда, доктор биологических наук, молекулярный генетик и руководитель научно-исследовательской группы по вопросам генной экспрессии и терапии медицинского факультета Королевского колледжа Лондона.
Краткосрочные эффекты от ГМО для здоровья человека, увы, никто специально тоже не отслеживает, но у нас есть записи беседы с американскими терапевтами, с которыми мы встречались в США. Они неоднократно сталкивались с тем, что люди, которые жаловались на проблемы с кишечником, на аллергические реакции, непереносимость той или иной пищи, начинали чувствовать себя гораздо лучше уже через две недели после того, как врачи прописывали им диету на основе органических продуктов (не содержащих ГМО и пестицидов),
— говорит Клэр Робинсон, одна из авторов книги, директор по научной работе некоммерческой организации Earth Open Source.
По мнению Робинсон, в этом случае трудно отделить влияние ГМО от влияния пестицидов, которые тоже содержатся в пище. Но если учесть, что 80 процентов ГМ-культур созданы, чтобы выдерживать повышенные дозы химикатов, и напичканы ими, то нельзя не признать связь этих двух проблем.
По всему миру проходят акции против применения глифосата. Фото: Oliver Berg / Globallookpress
Основной химикат, который благодаря компании «Монсанто» (теперь «Байер») вошёл буквально в каждый дом, — это глифосат. Он продаётся не только как обязательное дополнение к ГМ-семенам, которых в России официально быть не должно. В нашей стране это самое ходовое средство от сорняков. У него ещё с десяток наименований: «Торнадо», «Файтер», «Тайфун», «Напалм», «Чистогряд» и другие. Мы не только едим продукты, напичканные глифосатом, но и обрабатываем им газоны, грядки, леса.
«В 2015 году ВОЗ заявила о том, что этот гербицид может вызывать рак. Компания вывела глифосат на рынок в 70-х годах прошлого века. Понадобилось 45 лет, чтобы признать, что он опасен!» — подчеркнула Елена Шаройкина, директор Общенациональной ассоциации генетической безопасности, издавшей русский перевод книги. По её словам, мы ещё долго не узнаем правды о ГМО, ведь они были выведены на рынок лишь в самом конце прошлого века.
Да и как её узнать, если все решения о том, что из ГМО попадёт на тарелку потребителей завтра, принимается в лабораториях биотехнологических фирм?
«Нигде в мире уполномоченные агентства не проводят собственных испытаний безопасности и не поручают кому-либо ещё организацию таких исследований перед запуском массового производства ГМО. Напротив, они принимают решения о безопасности ГМО, опираясь на данные исследований, организованных и проведённых под контролем тех же самых компаний, которые получат прибыль в случае одобрения новой культуры», — говорится в книге.
Почему у человека меньше генов, чем у риса?
При создании ГМО один ген любого живого организма, например, яблони, может быть заменён на другой, удобный производителю, или какой-то «ненужный» ген может быть просто убран. Это делается различными способами, в том числе генным редактированием. Однако любой из них предполагает использование дополнительных материалов (например, бактерий или вирусов).
Однако до сих пор до конца не известно, какова роль генов в организме. Почему у людей столько же генов с закодированной информацией о производстве белков, сколько у плодовой мушки — около 21 тысячи? А сельскохозяйственные культуры, такие как рис, пшеница, кукуруза и соя, содержат гораздо больше генов, чем человек — от 30 до 50 тысяч. «Очевидно, что при определении характеристик организма важно скорее информационное наполнение генов, чем их количество», — утверждают авторы книги.
А что если информационное наполнение генов окажется гораздо большим, чем предполагали генные редакторы? Тогда убирая и/или добавляя даже один ген, можно спровоцировать в живом организме непредсказуемые изменения. Насколько оправдано это вмешательство, если речь не идёт о предотвращении смертельной болезни или столь же весомой причине?
На ГМ-животных ошибки генных инженеров видны лучше, и их сложнее скрыть. В 2019 году в США заявили о создании генетически отредактированных безрогих коров. Генные инженеры успешно «вклеили» в ДНК коров ген безрогости. Однако, по данным отчёта Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов, позже обнаружилось, что в геноме произошли и другие изменения, в результате которых коровы получили устойчивость сразу к трём антибиотикам. А значит, их сложно было бы вылечить от многих болезней. Это произошло, несмотря на то, что целевой ген был вставлен в ДНК животного верно и никаких сбоев при процедуре не происходило.
Генное редактирование предполагает использование дополнительных материалов (например, бактерий или вирусов). Фото: Norbert Michalke / Globallookpress
По мнению Клэр Робинсон, это связано с тем, что несмотря на точность генетических ножниц, как называют метод редактирования CRISPR Cas9, и «удачное» попадание целевого гена в ДНК, сама ДНК запускает процесс самовосстановления после разрезания, что и может привести к неожиданным последствиям.
Сможем ли быть сытыми без ГМО?
Сейчас генная инженерия в сельском хозяйстве применяется в основном на растениях. Что же опаснее — применять химикаты на обычных культурах или выращивать трансгенные, которые их не боятся? По данным статистики, зачастую фермерам приходится использовать на ГМ-растениях даже больше химикатов, чем на обычных.
Можно ли выращивать, скажем, пшеницу или сою при минимальном использовании химикатов или вовсе без них? Практика органического сельского хозяйства говорит, что можно. Скажется ли это на урожайности? Всё зависит от многих факторов. В целом же, по данным Продовольственной организации ООН (FAO) от 2007 года, органические продукты вполне способны накормить мир.
По данным других исследований, проводившихся в Университете Мичигана (США), глобальный переход на органическое производство уже сегодня дал бы возможность производить как минимум 2,641 Ккал продовольствия на человека в день, что немногим меньше существующего уровня производства — 2,786 Ккал. Однако это далеко не предел — при помощи такого вида сельского хозяйства вполне достижимы 4,381 Ккал на человека в день.
Но переход мира на технологии органики означает полный переворот в сельском хозяйстве, что, разумеется, невыгодно корпорациям-производителям химикатов и ГМО (как правило, это одни и те же компании) и поэтому звучит утопично.
Единственное, что остаётся обычному потребителю — внимательно относиться к своему питанию, чаще готовить самостоятельно, не покупать продукты, которые могут содержать большое количество химикатов, например, привезённые издалека (в том числе китайские) или несезонные овощи и фрукты или ГМ-компоненты — это, как правило, импортная соя и кукуруза.
Что такое генномодифицированные препараты
Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена — филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Минздрава России, Москва, Россия
Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена — филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Минздрава России, Москва, Россия
ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России
ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Минздрава России
Генная терапия — новое направление в медицине
Журнал: Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. 2016;5(2): 64-72
Безбородова О. А., Немцова Е. Р., Якубовская Р. И., Каприн А. Д. Генная терапия — новое направление в медицине. Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. 2016;5(2):64-72.
Bezborodova O A, Nemtsova E R, Iakubovskaia R I, Kaprin A D. Gene therapy is a new area in medicine. P.A. Herzen Journal of Oncology. 2016;5(2):64-72.
https://doi.org/10.17116/onkolog20165264-72
Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена — филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Минздрава России, Москва, Россия
В обзоре приведены сведения об истории и направлениях развития генной терапии. Обсуждены типы трансгенов, применяемые в лечении различных заболеваний, специфические и конституциональные промоторы, обеспечивающие экспрессию терапевтических трансгенов в клетках-мишенях, способы доставки генных конструкций в целевые клетки и механизмы внедрения генетического материала в ядро клетки. Рассмотрены преимущества и недостатки вирусных и невирусных векторов различных типов. Приведены данные последних лет о клиническом применении официнальных препаратов для генной терапии, зарегистрированных для лечения больных со злокачественными опухолями головы и шеи (Gendicine и Oncorine, Китай), с моногенным заболеванием — дефицитом липопротеиназы (Glybera, Нидерланды) и с ишемией нижних конечностей атеросклеротического генеза (неоваскулген, Россия), а также о клинических испытаниях препаратов для генной терапии в различных областях медицины.
Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена — филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Минздрава России, Москва, Россия
Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена — филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Минздрава России, Москва, Россия
ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России
ФГБУ «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Минздрава России
Достижения молекулярной биологии и генетики в изучении тонкой структуры генов эукариот, картирование генов на хромосомах млекопитающих, их идентификация и клонирование, обнаружение мутаций в генах, ассоциированных с наследственными и приобретенными заболеваниями, наряду с бурным ростом в области биотехнологий, клеточных технологий и успехами генной инженерии привели к тому, что в конце прошлого века начался бум в исследованиях по анализу молекулярно-биохимических дефектов, ассоциированных с определенной патологией, который привел к пониманию того, что большинство грозных заболеваний человека сопровождается серьезными изменениями в генетическом аппарате клетки. Особенно выражены и наиболее исследованы эти изменения при злокачественных новообразованиях. Из этих данных следует логичный вывод о том, что наиболее радикальным способом борьбы с заболеваниями, вызываемыми изменениями в генетическом аппарате клеток, должны быть мероприятия, направленные непосредственно на причину заболевания, а не ее последствия.
Генная терапия — это лечение наследственных, мультифакториальных и ненаследственных (инфекционных, злокачественных и др.) заболеваний путем введения генов в соматические клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых свойств.
История развития генной терапии началась в 1972 г., когда в США, в Стэндфордском университете, Стэнли Коэн и Герберт Бойер обнаружили явление прямого переноса фрагментов ДНК от одной бактерии кишечной палочки к другой при непосредственном контакте этих клеток. А уже в 1974 г. в США была учреждена первая в мире биотехнологическая компания «Genetech», где выращивали новые бактериальные культуры с чужими генами.
В 1976 г. в Университете Пенсильвания, США, Уильям Андерсон предложил использование вирусов в качестве носителей ДНК, а в 1990 г. этот исследователь в клинике Университета Пенсильвания ввел больной Ашанти ДеСильва с синдромом комбинированного иммунодефицита (СКИД) генетически модифицированные геном аденозиндезаминазы ее собственные лимфоциты, в последующие 3 года провел 23 внутривенных трансфузии и получил длительную ремиссию, а затем выздоровление.
В то же время метод генной терапии все шире распространялся по миру и к настоящему моменту в мире проведено и проводится более 2210 клинических испытаний по генной терапии. География их широка и разнообразна. Это — Америка (63,9%), Европа (24,1%), Азия (6,0%), Австралия (1,5%), международные (4,2%) [1]. По странам имеется распределение, свидетельствующее о том, что эта технология наиболее развита в США и ряде Европейских стран.
Спектр заболеваний, при которых проводятся клинические испытания по генной терапии, также чрезвычайно широк (табл. 1). Независимо от нозологии, в области соматической генной терапии имеются общие задачи. Это:
Таблица 1. Клинические испытания в области генной терапии
— выбор наиболее эффективного для лечения гена;
— разработка способов доставки требуемого гена в нужные клетки;
— изучение и обеспечение эффективных подходов и способов нужной регуляции гена;
— вопросы длительности существования и экспрессии введенного гена;
— обеспечение безопасности больного.
Типы генов, используемых при генной терапии, разнообразны, и их выбор определяется патогенетическими механизмами развития заболевания, идентификацией наиболее болезнетворных генов.
Наиболее простая задача в выборе гена стоит при моногенных наследственных заболеваниях, то есть там, где показано, что определенный дефект в данном гене вызывает патологический процесс. Совершенно другая задача по степени сложности в выборе гена для терапии стоит при многофакториальных заболеваниях, таких как злокачественные новообразования, кардиоваскулярные болезни, при которых в патогенезе заболеваний, во-первых, пока много неясного, во-вторых, задействован ряд генов.
Типы генов, описанные для клинических исследований, варьируют очень широко. Среди них 20,2% относятся к генам антигенов, 16,2% — цитокинов, 9,4% — различных рецепторов, 8,6% — факторов иммунодефицита, 7,4% — к «суицидным» генам, 7,4% — к генам факторов роста, 4,2%— ингибиторов репликации, 2,5% — маркеров, 13,2% — к генам других категорий белков, 2,5% — к неизвестным генам [1].
Для эффективной работы выбранный терапевтический ген снабжают сигнальными (регулирующими) элементами, которые необходимы для синтеза полноценной мРНК и целевого белка, а также позволяют управлять специфичностью экспрессии в определенном типе клеток или ткани, длительностью функционирования и нужной регуляцией гена в клетке (рис. 1) [2, 3].
Рис. 1. Схема генно-терапевтической конструкции.
Специфичность экспрессии генов в заданной клетке достигается конструированием векторов, несущих терапевтические гены под контролем промоторов, работающих только в данном типе клеток. К настоящему моменту выявлен ряд тканеспецифичных промоторов, обеспечивающих селективную экспрессию терапевтических трансгенов в клетках определенных органов. В экспериментальной генной терапии сердечно-сосудистых заболеваний в настоящее время используют промоторы, которые обеспечивают преимущественную экспрессию трансгена в миокарде (SM22α-промотор и др.) [4]. Разработан целый ряд тканеспецифичных промоторных систем, в которых использованы гены, высокоэкспрессированные, главным образом, в опухолевых клетках: простатспецифический и простатспецифический мембранный антигены при раке предстательной железы [5], гены, кодирующие сурфактантные белки, А и В, при раке легкого [6, 7], ген мембранно-связанного муцина MUC1/DF3 при раке молочный железы, трахеи, легкого, тонкого или толстого кишечника [8], ген α-фетопротеина — белка, синтезируемого в печени, при раке печени [9], промоторы гена сурвивина человека (hSurv) и гена обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT), обеспечивающих экспрессию трансгена в клетках широкого спектра опухолей [10, 11] (табл. 2).
Таблица 2. Опухолеспецифичные промоторы
Поскольку тканеспецифичные промоторы обладают общим недостатком — низким уровнем экспрессии гетерологичных генов, а также ограниченной областью применения, обусловленной их тканеспецифичностью, в настоящее время идет активный поиск промоторов генов человека, не обладающих тканевой специфичностью — универсальных или гибридных промоторов, направленных исключительно на пролиферирующие клетки и не затрагивающих нормальные дифференцированные клетки.
Одной из сложнейших проблем в генной терапии является доставка требуемого гена в нужные ткани при минимизации его контакта с биологическими средами организма до достижения клетки-мишени, а также обеспечение доставки гена в нужную клетку с целью его эффективной и безопасной работы в ней.
В настоящее время генетический материал доставляется в клетку либо в виде «голой» ДНК («naked DNA»)/плазмиды, в том числе в составе наночастиц и липосом, либо с использованием векторов вирусной и невирусной природы, защищающих ДНК от разрушения и имеющих тропность к определенным тканям (рис. 2) [12].
Рис. 2. Системы доставки генетического материала в клетку. (Адаптировано по: Thomas SM, Grandis JR. The Current State of Head and Neck Cancer Gene Therapy. 2009; Y20: 1565—1575 [12])
Самым простым способом доставки трансгенов является доставка «голой» ДНК/плазмиды. При этом для целей доставки генетического материала в ядро клетки используется арсенал различных средств. Это может быть физический метод доставки ДНК с применением таких приемов, как прямая инъекция «голой» ДНК, электропорация клеток и доставка ДНК через поры в обработанных мембранах, бомбардировка частицами с ДНК с использованием гидродинамической пушки [13].
На долю «голой» и плазмидной ДНК приходится всего 17,4% протоколов клинических испытаний в области генной терапии, что обусловлено их низкой трансфицирующей способностью. Это обстоятельство является большим ограничением для использования такого генетического материала в разработке метода генной терапии, несмотря на наличие у него ряда неоспоримых преимуществ: отсутствие инфекционности, низкая иммуногенность, высокая технологичность (доступность в получении в высокоочищенном состоянии в больших количествах, стандартность, стабильность при хранении и т. д.).
Альтернативным способом доставки терапевтических генов является использование векторов вирусной, бактериальной и химической природы. Вектор должен эффективно и специфически трансфицировать/трансдуцировать делящиеся и неделящиеся таргетные клетки, экспрессировать трансген в адекватных количествах в течение длительного времени, производиться легко и рентабельно по количеству и качеству, не быть иммуногенным и использоваться для повторного введения гена, являться безопасным при введении и не иметь побочных эффектов.
В качестве векторов для доставки генетического материала в клетку-мишень используют самые разнообразные вирусы, но наиболее распространены векторы на основе аденовируса (ADV), аденоассоциированного вируса, ретро- (RV), лентивируса (LV) и вируса простого герпеса (HSV) (табл. 3). При этом нативные полные вирусные частицы никогда не используются в качестве векторов, так как в этом случае есть опасность встраивания их генетического материала в клетки хозяина с целью приобретения метаболических и биосинтетических продуктов для вирусной транскрипции и репликации. Поэтому вирусы предварительно подвергаются существенной генетической модификации, приводящей к утере их репликационной способности и повышению тропизма к тканям и клеткам.
Таблица 3. Вирусные векторы для генной терапии
Вирусные векторы достаточно хорошо изучены, они имеют высокую эффективность трансфекции in vivo, для их наработки существуют коммерческие паковочные клеточные линии. Векторы на основе аденовируса и аденоассоциированных вирусов не встраиваются в геном клетки, а остаются эпихромосомными. Это уменьшает опасность мутагенеза, который может быть индуцирован при внедрении вируса в геном. При конструировании специфически направленных аденовирусных векторов эффективной оказалась замена вирусных промоторов, контролирующих основные транскрипционные области, так называемыми транскрипционными регуляторами, в результате чего экспрессия гена и репликация вируса происходят преимущественно в целевых клетках [14, 15].
Ретровирусные векторы интегрируют в геном хозяина, что при генной терапии обеспечивает стабильность и стойкую экспрессию трансгена в дочерних клетках, однако несет риск инсерционного мутагенеза, который может вызывать инактивацию генов-супрессоров опухолевого роста или активации онкогенов [16].
Необходимо отметить, что вирусные векторы обладают и другими недостатками. Так, они могут нести лишь небольшое количество генетического материала (до 30 кб). Кроме того, аденовирусные векторы 1-го поколения, в которых присутствуют все вирусные гены, обладают выраженной иммуногенностью, которая обусловливает развитие как клеточного, так и гуморального иммунного ответа, что приводит к разрушению не только самого вектора, но и клеток, трансдуцированных ими, и как следствие к ограничению срока экспрессии трансгена в 2—3 нед после трансдукции [17]. В настоящее время проблема иммуногенности таких векторов для генной терапии решается путем разработки конструкций, практически полностью лишенных вирусных генов, так называемых «gutless» вирусов или хелперзависимых (HD)/Ad векторов [18]. Исследования in vivo показали перспективность использования HD/Ad векторов для трансдукции клеток сосудистой системы и миокарда [19].
Несмотря на описанные недостатки, вирусный метод доставки трансгенов в клетки успешно развивается и в настоящее время является доминирующим: около 70% клинических исследований посвящено изучению генетических конструкций, снабженных вирусными векторами.
В то же время в последние годы активно разрабатываются невирусные системы доставки генетического материала с использованием высокомолекулярных химических соединений для конденсации с ДНК: липидсвязанные комплексы — липоплексы либо поликатионные комплексы, имитирующие поверхность вируса — полиплексы (табл. 4). Эти наночастицы защищают плазмидную ДНК в межклеточном пространстве от деградации нуклеазами и облегчают проникновение в клетки-мишени. Положительно заряженные комплексы связываются со специфическими рецепторами (при наличии на их поверхности макромолекул, обладающих свойствами специфического лиганда) или непосредственно с поверхностью клетки. Комплексы проникают в клетку по механизму эндоцитоза. После высвобождения из эндосомы и разборки комплекса нуклеиновая кислота проникает через поры в ядро клетки [20].
Таблица 4. Невирусные векторы для генной терапии
Невирусные системы на основе катионных липидов или полимеров имеют ряд преимуществ перед вирусными системами доставки: большой объем несущей ДНК, отсутствие какой-либо вирусной составляющей, а следовательно, низкая иммуногенность, высокая технологичность производства. Однако низкая трансфицирующая способность невирусных векторов и недостаток информации о безопасности у человека тормозят развитие исследований в этом направлении, только 5,2% приходится на клинические испытания, где в качестве системы доставки терапевтических генов используют липоплексы или полиплексы.
К настоящему моменту сформировалось два типа геннотерапевтического воздействия: индивидуализированный подход ex vivo — трансфекция стволовых гемопоэтических клеток, полученных из периферической крови и трансплантированных затем больному, и in vivo — трансфекция клеток внутри организма, куда генетический материал в составе вектора доставляется в результате внутривенной или внутриартериальной (в печеночную артерию) инфузии, внутримышечного, подкожного, интратуморального, интраназального или сублингвального введения. В практике лечения сердечно-сосудистых заболеваний испытываются прямые игольные инъекции конструкций в миокард, введение вирусных векторов при помощи разнообразных катетеров, использование стентов с покрытиями, обеспечивающими дозированный выход лекарственного средства. В онкологии используют, как правило, внутриопухолевое введение целевого гена в составе различных векторов.
На долю заболеваний, для которых разрабатываются методы генной терапии, большая часть приходится на злокачественные новообразования. Злокачественная трансформация клетки происходит в результате накопления генетических дефектов, приводящих к их аномальному росту, непосредственной причиной которых является дисбаланс в пролиферации и гибели клеток. Поэтому разработка способов коррекции этих дефектов является основой генной терапии злокачественных новообразований. Подходы к генной терапии рака включают в себя три основные стратегии: введение нормального гена в опухолевые клетки для замены «мутантного» гена, генетическую модификацию, преследующую цель заглушить «мутантный» ген, и генетические подходы, направленные на запуск гибели опухолевых клеток (табл. 5).
Таблица 5. Подходы к генной терапии онкологических заболеваний
Представления о патогенезе злокачественных новообразований, в основе которого, в том числе, лежат активация онкогенов и инактивация генов-супрессоров опухолевого роста, позволяют искать пути подавления или восстановления функции этих генов.
К настоящему моменту известно более 24 генов-супрессоров, среди них наиболее изученным является ген р53, контролирующий клеточный цикл и поврежденный в ≈50% опухолей человека [21]. Так, коррекционная замена мутантного гена p53 в опухолевых клетках геном дикого типа (не содержащим мутаций) с помощью методов генотерапии приводила к восстановлению функций белка p53 и инициации процессов, запускающих программированную гибель злокачественных клеток. Клинические испытания аденовирусного вектора Ad-p53 показали, что восстановление дикого типа р53 путем доставки гена при помощи дефектного по репликации Ad приводило к значительному противоопухолевому эффекту на фоне низкой общей токсичности [22]. Более того, восстановление р53 сопровождалось увеличением чувствительности опухолевых клеток к химио- и радиотерапии [23].
Технология «молчащих» генов — одна из новейших технологий в генотерапии рака, направлена на сайленсинг (silence — молчание) генов, отвечающих за рост и/или деление раковых клеток, так называемых онкогенов. «Заглушить» гены можно за счет адресной доставки малых интерферирующих двухцепочечных РНК (siRNA), которые блокируют экспрессию гена в результате гомологичной рекомбинации (РНК-интерференция) [24, 25]. Также малые РНК, образующие «шпильки» во вторичной структуре (shRNA), могут быть использованы для подавления экспрессии генов путем РНК-интерференции.
Направленная доставка siRNA была апробирована в клинических испытаниях: CALAA-01 («Calando Pharmaceuticals») для пациентов с меланомой [26] и ALN-VSPOI («Alnylam Pharmaceuticals») для лечения рака печени и других солидных опухолей [27]. Предварительные результаты исследования CALAA-01 и ALN-VSPOI показали безопасность и хорошую переносимость siRNA, что является подтверждением целесообразности продолжения испытаний для продвижения данного подхода к лечению заболеваний онкологического профиля.
Одним из активно развивающихся направлений генной терапии рака является энзиматическая терапия (Gene-Directed Enzyme Prodrug Therapy, GDEPT), основанная на запуске гибели опухолевых клеток за счет придания им способности превращать вводимый в организм препарат-предшественник в токсичный метаболит. Это достигается введением «суицидных» генов, кодирующих фермент вирусного или бактериального происхождения, который в клетках, где он экспрессируется, конвертирует свой субстрат, превращая его из нетоксичного пролекарства в токсичный для клетки метаболит [28]. Наиболее изученными системами «суицидный» ген/пролекарство являются: ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSVtk)/ганцикловир, ген цитозиндезаминазы (CD)/5-фторцитозин, цитохром P450 (p450)/циклофосфамид и другие [29]. Основная проблема, препятствующая применению этой стратегии в клинической практике, — довольно низкая эффективность доставки терапевтических генов. Несмотря на это, число проведенных клинических испытаний GDEPT растет с каждым годом [1]. Среди препаратов, предназначенных для GDEPT, можно выделить Sitimagene ceradenovec (Cerepro, «Ark Therapeutics Group Plc», Великобритания и Финляндия) на основе аденовирусного вектора со встроенным «суицидным» геном HSVtk. Этот препарат прошел I/II фазы клинических испытаний (глиома), в которых показана безопасность внутриопухолевой доставки вирусной тимидинкиназы в глиальные клетки, при этом отмечена стабилизации процесса у пациентов [30, 31].
Генная терапия рака, направленная на разрушение опухолевых клеток, возможна с использованием вирусов, которые с помощью специальных генетических манипуляций становятся онколитическими, т. е. селективно воздействуют только на опухолевые клетки, вызывают лизис инфицированных клеток и последующую трансдукцию окружающих опухолевых клеток, что в несколько раз увеличивает их терапевтический индекс. Существуют две основные стратегии получения онколитических вирусов: путем делеции (мутации) основных вирусных генов, функции которых могут быть восполнены только в опухолевых, но не в нормальных клетках (делеционные мутанты), и путем регуляции экспрессии основных вирусных генов за счет помещения их под ткане- или опухолеспецифичные транскрипционные регуляторные элементы (транскрипционная регуляция). Препараты на основе онколитических вирусов разрабатывают с использованием РНК- и ДНК-содержащих вирусов, таких как аденовирус, реовирус, вирус простого герпеса, поксвирус. Так, клинические испытания онколитических вирусов ONYX-015 и Н101 на основе мутантных аденовирусов с делецией в гене Е1В и с делецией в генах Е1В и Е3 соответственно, которые селективно реплицируются в опухолевых клетках с дефектным р53, показали безопасность и эффективность при интратуморальном введении в терапии ряда опухолей [32, 33]. В настоящее время проходят клинические испытания препарата REOLYSIN («Oncolitic Biotech. Inc.», Канада), полученного на основе штамма Т3D реовируса человека. В этих исследованиях показана низкая токсичность при внутриопухолевом и внутривенном его введении в режиме монотерапии, а в сочетании с противоопухолевыми препаратами, такими как гемцитабин для рака поджелудочной железы и легкого, доцетаксел для рака мочевого пузыря, предстательной железы и легкого, паклитаксел с карбоплатином для меланомы, рака легкого и яичников, показана высокая противоопухолевая эффективность [34].
Наиболее успешным онколитическим препаратом является OncoVexGMCSF на основе вируса простого герпеса, который проходит II/III фазы клинических испытаний для лечения меланомы, рака молочной железы, опухолей головы и шеи. В геноме этого вируса сохранен ген тимидинкиназы для проведения GDEPT, но удалены обе копии ICP34.5 гена, отвечающего за вирусную репликацию в нормальных клетках, а в область ICP47 встроен ген GM-CSF. Продуцируемый GM-CSF привлекает дендритные клетки (DC) и может стимулировать выброс цитотоксических Т-лимфоцитов [35].
Следует отметить, что современная стратегия развития иммунотерапии рака на фоне расширяющихся знаний о функционировании иммунной системы и формировании иммунного ответа является главной предпосылкой для усовершенствования подходов к лечению с привлечением инновационных лекарственных средств, созданных методами генной инженерии, таких как генные вакцины.
Исследования в этой области ведутся в трех направлениях: модификация опухолевых клеток для придания им большей иммуногенности, введение генов опухолеассоциированных антигенов в дендритные клетки, геномодификация лимфоцитов для повышения цитотоксического ответа.
К настоящему моменту разработана «платформа», представляющая собой два рекомбинантных вектора: на основе поксвирусов коровьей оспы (RV) для первичной вакцинации и птичьей оспы (RF) для ревакцинации с тремя костимуляторными молекулами [В7.1 (CD80), ICAM-1 (CD54) и LFA-3 (CD58), обозначаемыми TRICOM] для повышения иммунного ответа [36—38]. Каждый из этих векторов может содержать трансген для одного или нескольких опухолевых антигенов, например, таких как гены, кодирующие простатспецифический антиген (PSA), раково-эмбриональный антиген (СЕА), мембранно-связанный муцин (MUC-1) и другие. Разработаны вакцины PROSTVAC (RV-, RF-PSA-TRICOM) для иммунотерапии рака предстательной железы [39, 40] и PANVAC (RV-, RF-СЕА-MUC1-TRICOM) для иммунотерапии рака молочной железы, прямой кишки, яичников. Полученные на сегодняшний день результаты применения вакцин выглядят обнадеживающими в плане их переносимости. Однако в плане эффективности наблюдается лишь непродолжительная стабилизация процесса. Несмотря на это, синергизм иммунотерапии и химиотерапии, полученный в ряде клинических испытаний, является подтверждением целесообразности применения вакцин в сочетании с другими методами лечения [41].
Метод, известный как технология химерных антигенных рецепторов, или CAR-технология (от англ. chimeric antigen receptor), в настоящее время является одним из наиболее перспективных и быстро развивающихся направлений в области иммунотерапии злокачественных новообразований [42]. Эта технология заключается в выделении из периферической крови пациента Т-лимфоцитов и их двухкомпонентной модификации в условиях ex vivo: присоединение к их поверхности рецептора, распознающего экспрессируемый большинством лейкемических клеток белок CD19, и введение мощного внутриклеточного механизма, запускающего активный рост и деление клеток в ответ на их взаимодействие с белком-мишенью. Такие генномодифицированные Т-лимфоциты возвращают в кровоток пациента. Предварительные результаты исследований свидетельствуют о том, что этот подход позволяет получить хорошие результаты у 2/3 пациентов, не ответивших на традиционные методы лечения [43—45].
Микроокружение опухоли играет важную роль в прогрессии и метастазировании. Оно включает в себя строму с фибробластами и эндотелиальными клетками сосудов. Вмешательство в эту микросреду также может привести к регрессии опухоли. Наиболее важной «точкой приложения» является ангиогенез. В условиях опухолевого роста активируется выброс проангиогенных цитокинов, таких как сосудистый эндотелиальный фактор роста (VЕGF) и фактор роста фибробластов (FGF). Эти факторы стимулируют рост микрососудов вокруг опухоли с последующей прогрессией и метастазированием. Альтернативой терапии рекомбинантным (гуманизированным) моноклональным антителом бевацизумаб, которое селективно связывает и ингибирует активность VEGF, может стать генная терапия. Предварительные результаты клинических испытаний показали, что доставка антиангиогенных генов, кодирующих белки ангиостатин и эндостатин с помощью аденоассоциированного вектора, вызывает регрессию опухоли с минимальными побочными эффектами [15].
Таким образом, генная терапия достигла определенных успехов: разработаны подходы, сконструировано более 2 тыс. препаратов, прошедших доклинические исследования, проведены клинические испытания в ряде областей медицины. К настоящему моменту в мире уже зарегистрировано четыре препарата для генной терапии (табл. 6). Гендицин (Shenzhen SiBiono GenTech) и Oncorine (H101) (Sunway Biotech Co) — это первые генно-терапевтические препараты, допущенные к клиническому применению в Китае в 2003 и 2005 г. соответственно, для лечения плоскоклеточного рака головы и шеи [46]. Препарат Glybera (uniQurо), созданный на основе аденоассоциированного вектора, в геном которого встроен вариант гена липопротеиназы LPL s447x для лечения моногенного заболевания — дефицита липопротеиназы, вызванного мутацией в гене, кодирующем выработку этого фермента, допущенный к применению в 2012 г. Европейским агентством по оценке лекарственных препаратов (EMA) [47]. Препарат неоваскулген, представляющий собой высокоочищенную сверхскрученную плазмиду с геном VEGF165, кодирующий эндотелиальный фактор роста сосудов под контролем цитомегаловирусного промотора, предназначен для лечения пациентов с ишемией нижних конечностей атеросклеротического генеза и зарегистрирован в России в 2011 г. [48].
Таблица 6. Официнальные препараты для генной терапии различных заболеваний
В настоящий момент в России, так же как и за рубежом, продолжается развитие этого метода. Так, во II фазе клинических испытаний находятся цельноклеточные генномодифицированные вакцины аллоген (из клеточной линии меланомы человека mel P/tag7) и мелавак (из клеточной линии меланомы mel Ког/GM-CSF), показавшие безопасность и эффективность при лечении меланомы [49]. На стадии клинических испытаний находится препарат канцеролизин, разработанный на основе аденовируса 5-го типа, у которого был полностью делетирован ген белка Е1 В по аналогии с известным штаммом ONYX-015 (ФГУН ГНЦ «Вектор», Россия) [50]. I фазу клинических испытаний проходит препарат АдеЛакт («НТфарма», Россия), представляющий собой рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, несущие ген лактоферрина человека (hLf). Этот препарат, предназначенный для терапии токсикозов различного генеза III и IV степени, проходил доклинические испытания в Московском научно-исследовательском онкологическом институте им. П.А. Герцена — филиале ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России [51]. На этой же базе идут доклинические испытания АнтионкоРАН-М — препарата для противоопухолевой «суицидной» терапии на основе рекомбинантной ДНК, кодирующей гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSVtk) и колониестимулирующего фактора (GM-CSF) с невирусной системой доставки, разработанного в результате совместных исследований, проведенных в ФГБУН ИМГ РАН, ФГБУН ИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и МГУ им. М.В. Ломоносова [52].
Заключение
Таким образом, использование метода генной терапии может быть результатом уже не столь отдаленного будущего, но говорить о реальных перспективах этого направления в медицине, по-видимому, пока преждевременно. Несмотря на то, что большинство клинических испытаний свидетельствует об относительной безопасности геннотерапевтических препаратов, требуется время для окончательного доказательства их эффективности. Возможно, в будущем метод генной терапии станет основным в лечении наследственных заболеваний, а для заболеваний онкологического профиля генная терапия будет рассматриваться как часть комплексного противоопухолевого лечения.