Цитометрия что это такое
Проточная цитометрия: что это, принципы, применение
Масс-спектрометрия — один из точнейших методов идентификации веществ. Фактически это своеобразное «взвешивание» молекул: компоненты ионизируются, затем определяется отношение массы к заряду ионов.
Звукохимия или Сонохимия (Sonochemistry) — это раздел химии, который изучает взаимодействие мощных акустических волн и возникающие при этом химические и физико-химические эффекты.
Что это такое?
Проточная цитометрия — способ исследования качества и количества клеток, которые по одной штуке проходят через узкий капилляр. Для этого клетки помечаются флюоресцентными антителами или антигенами. Оборудование для такого исследования называется цитометром.
Цитометрия называется «проточной», потому что клетки исследуются в протоке. Благодаря микрокапиллярной системе клетку можно выделить и изучить отдельно.
Принципы метода проточной цитометрии
Клеточную суспензию метят флуоресцентными красителями, после чего вместе с потоком жидкости пропускают через проточную ячейку. Клетки вынуждены «выстраиваться» друг за другом, благодаря чему становится возможным брать исследовать конкретную.
После отделения клетка облучается лазером, а затем сигналы рассеивания/свечения регистрируются на специальном аппарате.
Размер клетки определяется за счёт рассеивания света под углом до 10°, размеры ядра и цитоплазмы — за счёт рассеивания под углом до 90°. Также учитывается интенсивность флуоресцентного свечения по 30 каналам. Глядя на эти показатели, лаборант определяет, из чего состоит клетка.
Преимущества проточной цитометрии крови и других тканей организма
Применение проточной цитометрии
Сегодня это очень востребованный метод клеточного анализа. Он применяется для изучения аспирата костного мозга, крови, ликвора, асцитической, плевральной, суставной жидкостей, тканей (особенно опухолевых), а также суспензии микрочастиц. Применение проточной цитометрии даёт возможность диагностировать онкологические заболевания, позволяет наблюдать за пациентами, находящимися в группе риска, оценивать состояние иммунной системы, выявлять специфические маркёры.
В целом, метод проточной цитометрии используется в разных направлениях медицины, фармакологии и даже сельского хозяйства. Например:
Метод успешно используется в трансплантологии и микробиологии. Есть заболевания, при которых цитометрия не рекомендуется: это лимфома Ходжкина, миелодиспластический синдром и миелобластный лейкоз. Вместе с тем, с помощью данной методики врачи могут мониторить терапию и отслеживать состояние пациентов с указанными заболеваниями.
Проточная цитометрия также показала себя эффективной и полезной при беременности.
Проточная цитометрия
Проточная цитометрия — метод оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов.
Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.
Содержание
Образцы
Принцип
Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:
Флуорохромы
«Квантовые точки» QD560, QD590 и т. д.
Преимущества
Применение
Иммунология
Онкология
Цитология
Гематология
Фармакология
В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определённых клеток в исследуемых образцах (как бактериальных и грибковых, так и собственных клеток организма человека), определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов.
Выявление бактериальных, грибковых, а также собственных клеток организма в биологических жидкостях крайне важно для диагностики многих заболеваний. В ходе одного из исследований было показано, что проточная цитометрия обладает в 100—1000 раз более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10-100 в 1 мл крови. При более низкой концентрации бактерий в образце возможно проведение предварительной инкубации. Высокую чувствительность методу придает использование моноклональных антител, помеченных флуоресцирующим веществом.
Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов. Подвергнутые воздействию антибиотиков (in vivo или in vitro) микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т. п., что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия.
Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов (отношение CD4+/CD8+). Методика может также использоваться для контроля эффективности проводимой терапии.
Проточная цитометрия в диагностике лимфопролиферативных заболеваний
Заболеваемость злокачественными заболеваниями кроветворной и лимфоидной ткани (гемобластозами) с каждым годом увеличивается во всем мире.
По данным канцер-регистра Республики Беларуси, за 1999-2008 гг. стандартизованные показатели заболеваемости лейкозами и лимфомами составляли 20,1 на 100 000 населения. Неуклонно увеличиваются показатели смертности больных с лейкозами и злокачественными лимфомами.
Уровень 5-летней выживаемости больных с гемобластозами остается по-прежнему низким.
Под термином «лимфома» понимают большое количество различных видов заболевания, существенно отличающихся друг от друга по своим проявлениям и подходам к их лечению. Все лимфомы разделяют на 2 большие группы: лимфома Ходжкина (ЛХ) и неходжкинские лимфомы (НХЛ). Решение о принадлежности лимфомы к группе неходжкинских лимфом или к болезни Ходжкина принимается после гистологического исследования образца биопсированной ткани. Если при микроскопическом исследовании находят специфические для болезни Ходжкина клетки Березовского-Штернберга-Рида, то ставят диагноз болезни Ходжкина. Если эти специфические клетки не находят, то лимфому относят к группе неходжкинских. Неходжкинские лимфомы (НХЛ) — гетерогенная группа злокачественных лимфопролиферативных опухолей, различающихся по биологическим свойствам, морфологическому строению, клиническим проявлениям, ответу на терапию и по прогнозу. Вероятность развития неходжкинских лимфом значительно повышается с возрастом — почти в 20 раз после 80 лет. По темпу прироста заболеваемость НХЛ опережает ЛХ. Средний возраст пациентов с НХЛ 50-60 лет.
За 170 лет изучения злокачественных НХЛ, в отличие от ЛХ, претерпели множество терминологических изменений: лимфосаркома, злокачественная лимфома, лимфобластома, ретикулосаркома, гематосаркома и др., что свидетельствует о клинико-морфологической сложности данной группы заболеваний.
Хронические лимфопролиферативные заболевания (ХЛПЗ) объединяют целую группу биологически различных опухолей, возникающих в результате накопления и/или пролиферации клональных морфологически зрелых лимфоцитов. Сама природа этих клеток делит заболевания на две большие группы: Т-клеточные и В-клеточные хронические лимфопролиферативные заболевания, внутри которых на основании клинических проявлений и опухолевого происхождения выделяют:
Иммунофенотипическая диагностика ХЛПЗ по фенотипическому профилю клеток периферической крови возможна только в двух ситуациях:
Проведение диагностического ИФТ оправдано при выявлении в периферической крови абсолютного и относительного лимфоцитоза. Пороговый уровень лимфоцитоза, при котором считается необходимым проводить диагностическое ИФТ за последние годы снизился с 10х10 9 /л [74] до 5х10 9 /л.
С начала 80-х годов ХХ века, когда развитие гибридомной технологии позволило получать моноклональные антитела любой специфичности, стало возможным нарастающее по сложности и объему информации иммунофенотипирование.
Проточная цитометрия (ПЦ) является интегральным инструментом изучения различных биологических систем с помощью регистрации флюоресценции и использования флюоресцентных красителей, способных связываться с различными компонентами клетки.
В основе метода проточной цитометрии лежит измерение оптических свойств клеток. Клетки по одиночке вводятся в ламинарный поток в проточной кварцевой кювете, где они пересекают сфокусированный световой пучок, не касаясь стенок кюветы. Источником света могут быть различные лазеры, ультрафиолетовая лампа или их комбинация. Свет определенной длины волны возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей, связанных с различными клеточными компонентами, при этом может происходить одновременное возбуждение нескольких разных красителей, что позволяет оценивать сразу несколько клеточных параметров. Свет, испускаемый красителями, собирают с помощью системы линз и зеркал и раскладывают на компоненты. Световые сигналы улавливаются и преобразуются в электрические импульсы фотоумножительным устройством. Далее информация обрабатывается в цифровом режиме. Величины, измеренные фотоумножителем, отображаются на гистограммах. Современные проточные цитофлуориметры позволяют одновременно измерять несколько (до восьми) параметров: рассеяние света на малые углы (до 10°), которое еще называют прямым светорассеянием (forward scattering или FSC); рассеяние света на угол 90°, т.н. боковое светорассеяние (side scattering или SSC]; интенсивность флуоресценции на разных длинах волн. Параметры светорассеяния позволяют проводить разделение клеток по размерам, форме, состоянию клеточной мембраны и характеристикам цитоплазмы.
Традиционно концентрация клеток определяется путем разделения пробы на две части и сравнение результатов анализа иммунофенотипирования, выполненного на проточном цитометре с результатами подсчета клеток на гематологическом анализаторе. Такая процедура приводит к дополнительным затратам времени, средств и мощностей лабораторного оборудования. В настоящее время на рынке имеются наборы калибровочных частиц для определения концентрации клеток непосредственно на проточном цитометре, однако их использование также связано с дополнительными затратами. Проточные цитометры являются полностью открытыми системами, что не ограничивает пользователя в выборе реагентов.
При анализе клеток, маркированных двумя, тремя или четырьмя антителами, коньюктированными с различными цветовыми метками, необходимо проводить компенсацию сигналов с флуоресцентных каналов проточного цитометра из-за перекрытия спектров эмиссии используемых красителей.
Проточная цитометрия позволяет определить долю клеток, находящихся в S-фазе и оценить степень пролиферации. С помощью ДНК-гистограмм возможно четко разделить клетки, находящиеся в G1-, S- и G2/M-фазах клеточною чикла. Совокупность информации о содержании ДНК, маркеров апоптоза и клеточной пролиферации, имеет важное значение в дифференциальной диагностике онкологических заболеваний крови и солидных опухолей.
Диагностика лейкозов, лимфом в настоящее время одна из наиболее передовых областей использования проточной цитометрии. Иммунофенотипирование клеток крови и костного мозга обеспечивает ключевой информацией для качественной диагностики и оценки прогноза заболевания.
Трансплантация костного мозга (ТКМ) при лимфомах и лейкозах предполагает перенос стволовых мультипотентных клеток, ответственных за восстановление нормального гемо- и лимфопоэза, в противоположность гемотрансфузиям, которые дают временный эффект. Кроветворные клетки для ТКМ могут быть получены из костного мозга, периферической и пуповинной крови. Процедура ТКМ более не является экспериментальным методом, а составляет важный компонент в лечении онкологических и наследственных заболеваний. Рецептор CD34 используется как маркер полипотентных кроветворных стволовых клеток. Подсчет абсолютного числа CD34+ клеток при помощи проточной цитометрии является золотым стандартом в оценке количества кроветворных клеток.
Таким образом, проточная цитометрия имеет достаточно широкие возможности для решения различных диагностических и исследовательских задач, делая лабораторное исследование технологичным, точным и своевременным.
Широкие возможности ее применения связаны с тем, что интенсивность флюоресценции прямо пропорциональна количеству контролируемого вещества в клетке, однако при определенных условиях могут быть зарегистрированы очень малые количества флюорохрома, в том числе меньше 1000 молекул на клетку. Некоторые флюоресцентные красители могут менять параметры флюоресценции внутри живых клеток и превращаться из нефлюоресцирующих во флюоресцирующие под воздействием определенных ферментов, изменять спектр флюоресценции под действием ионов кальция, их можно применять при конструировании молекулярных зондов.
Возможности ИФТ в прогнозировании течения и исхода онкогематологических заболеваний во многом определяются адекватным набором антител для первичной диагностики.
Развитие технологий в области мультипараметрического анализа, гейтирования по CD45, автоматизированного анализа кластеров и стандартизации аппаратуры достаточно быстро перевело проточные цитометры из разряда приборов научного использования в рутинное оборудование клиник и сделало саму ПЦ стандартом лабораторной диагностики в области иммунофенотипирования клеток. Выявление молекул, тем или иным образом интегрированных с клеточной мембраной, является только одной из сфер применения ПЦ, но именно она имеет максимальное диагностическое значение.
Все большее количество определяемых параметров позволяет изучать все более сложные фенотипы нормальных и злокачественных лейкоцитов, и, следовательно, все более тонкие аберрации, выделяющие опухолевую клетку в присутствии нормальных клеточных компонентов крови и костного мозга. Эти возможности и превратили проточную цитометрию в метод выбора при определении линейной принадлежности и уровня созревания злокачественных клеток при острых лейкозах и лимфомах.
Виды биологического материала, направляемого на тестирование для выявления лейкоза/лимфомы и определения их природы, достаточно разнообразны: периферическая кровь, аспират костного мозга, трепанобиоптат, взвесь клеток лимфатического узла, ликвор, плевральная жидкость.
Мультипараметрический анализ позволяет уменьшить необходимый объем образца, время пробоподготовки и фактического анализа, сокращая тем самым путь от получения биологического материала до клинического результата – иммунофенотипического диагноза. Проточная цитометрия предоставляет три типа данных:
Последующая экспертная оценка всей совокупности данных, ведущая к установлению диагноза является дополнительным источником вариабельности окончательных результатов за счет выбора метода оценки антигенной экспрессии и критериев интерпретации первичных данных.
Мультипараметрические возможности оценки клеток стали использовать для выявления фенотипических аберраций лейкозных клеток с максимальной вероятностью специфических генетических поломок для подтверждения которых необходима молекулярная диагностика. Известно, что среди пациентов с идентичным, в том числе нормальным, кариотипом или генетическими аберрациями прогрессия заболевания различна и не всегда предсказуема, что требует поиска дополнительных критериев информации, которыми могут оказаться данные ИФТ. При невозможности получить метафазные пластинки выявление хромосомных аберраций может быть осуществлено с помощью молекулярных проб и определения профиля экспрессии генов в злокачественных клетках. Немногочисленные работы применения микроэррей-технологии при острых лимфобластных лейкозах показали перспективность этого направления при поиске новых прогностических признаков генетических нарушений и прогноза заболевания. К сожалению, молекулярно-биологические исследования не являются рутинными для многих, в том числе специализированных, клиник, а там, где осуществляются, получение информации значительно дистанцировано во времени от получения биологического материала. С клинической точки зрения, это, скорее, подтверждающие (или отрицающие) диагноз исследования, но не определяющие его.
Для проведения иммунофенотипической диагностики лейкозов и лимфом необходимо выделить клетки, являющиеся субстратом заболевания. До появления методических возможностей работы с цельной кровью (костным мозгом) при диагностике гемобластозов только использование градиентного центрифугирования создавало возможность анализа трансформированных клеток, патологических лимфоцитов и бластов. За такое увеличение относительного содержания опухолевых клеток приходилось платить потерей возможности оценить клеточный состав образца в целом. Поэтому, если еще в середине 90-х годов ХХ века выделение мононуклеаров на градиенте плотности расценивалось как обязательный этап пробоподготовки, то позднее пришли к однозначному предпочтению лизиса при работе с образцами онкогематологических пациентов.
Для определения возможности проведения ИФТ необходима информация о количестве лейкозных бластов в образце, так как при их низком содержании (менее 20%) фенотипический профиль бластной популяции может быть оценен неправильно. Принято считать, что относительное содержание бластов указано в миелограмме, сопровождающей костный мозг, направляемый на ИФТ. Однако на практике нередко материал стернальной пункции одновременно направляется морфологу для получения детальной миелограммы и иммунологу для определения варианта лейкоза, т.е. клеточность образца неизвестна. Кроме того, возможное разведение костного мозга периферической кровью может серьезно влиять на конечный результат исследования. Следствием этого оказывается необходимость вносить специфические антитела в избытке, а не из расчета на количество клеток. Для определения уровня бластоза при ПЦ необходимо средствами программного обеспечения отделить собственно клетки от дебриса и сдвоенных клеток, которые могут в разном количестве присутствовать в анализируемом образце и особенно часто выявляются при хронических лимфопролиферативных заболеваниях.
Основной задачей ИФТ является получение информации, которая позволяет установить факт наличия гемобластоза и его иммунологический вариант, а последующая их интерпретация предполагает интегральный анализ ИФТ и других клинических и лабораторных данных.
Литература
Цитометрия что это такое
Подводные камни проточной цитометрии в диагностической гематопатологии
Аннотация
Проточная цитометрия (ФК) оказалась чрезвычайно универсальным и полезным инструментом для диагностики и мониторинга гематологических заболеваний в дополнение ко многим другим применениям. Значительные достижения в области электроники, программного обеспечения и реагентов за последние годы упростили некоторые аспекты ФК, в то же время способность комбинировать 8–10 антител в одной пробирке может создать как технические, так и интерпретационные проблемы, которые труднее обнаружить при использовании только 3–4 цветовых комбинаций. Использование многопараметрических панелей может облегчить идентификацию аномальных популяций; Однако характеристики опухолевого населения могут создавать потенциальные диагностические ошибки. Понимание нормальных иммунофенотипических паттернов в состоянии покоя, восстановления, и активация является критическим первым шагом для того, чтобы надлежащим образом идентифицировать аномальные популяции, которые характеризуют гематопоэтические новообразования. Кроме того, внедрение новых терапевтических стратегий, в частности таргетной терапии, может смешивать стандартные методы анализа данных проточной цитометрии, и знание влияния терапии на данные проточной цитометрии имеет решающее значение для точной интерпретации данных. В этой рукописи будут рассмотрены вопросы доаналитического анализа, инструментов и интерпретации, которые могут привести к неправильной интерпретации результатов.
2 ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ
Образцы, полученные для ПЦ, должны быть проверены на наличие признаков плохого обращения после сбора. Например, свернутые или гемолизированные образцы могут не отражать исследуемого состояния заболевания. Образцы, загрязненные периферической кровью, показывают увеличенное количество зрелых гранулоцитов, и это должно быть отмечено в окончательном отчете. Жизнеспособность часто вызывает беспокойство, когда образцы ткани собирают, и по этой причине их следует помещать в консервирующую среду [например, среду 199 или среду Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640] сразу после сбора. Все образцы должны быть оценены на жизнеспособность. В большинстве лабораторий график прямого рассеяния в зависимости от бокового рассеяния (SSC) используется для исключения мусора и получения грубой оценки жизнеспособности. Один метод, используемый в некоторых лабораторных условиях, в частности, при оценке образцов тканей следует включать в анализ образцов жизнеспособный краситель (например, 7AAD или амино-реактивные флуоресцентные красители). Такие красители могут быть добавлены к образцу и проанализированы с помощью FC, чтобы обеспечить точную оценку качества исследуемого материала. Образцы тканей, отправляемые в реферальные лаборатории, часто могут извлечь выгоду из использования флуоресцентных красителей жизнеспособности, поскольку дегенеративные клетки могут быть трудно исключить только с помощью рассеяния света. Преимущества такого удаления достигаются за счет уменьшения максимального количества антигенов, доступных для данной пробирки. Лаборатория, обрабатывающая только периферическую кровь из собственного учреждения, может посчитать использование красителя жизнеспособности менее важным, чем региональная или национальная референс-лаборатория, которая получила большое количество образцов ткани. Как правило, образцы либо промывают, окрашивают, и затем добавляют буфер для лизиса, или образцы можно окрашивать, лизировать и затем промывать. Для обнаружения поверхностного иммуноглобулина важно, чтобы образцы были промыты минимум два раза в физиологическом растворе с фосфатным буфером перед окрашиванием для удаления цитофильных антител. фигураНа фиг.1 показано влияние увеличения степени промывки на отделение поверхностного окрашивания каппа и лямбда в образце крови. В случаях, когда встречаются необычные или неожиданные схемы окрашивания, промывка для удаления компонентов плазмы может улучшить качество данных. Кроме того, некоторые клоны антител могут быть более восприимчивыми к таким взаимодействиям (Wood & Levin, 2006 ).
Некоторые образцы могут демонстрировать устойчивость к лизису эритроцитов (RBC) в зависимости от болезненного состояния пациентов или лекарственной терапии (Kasinrerk, 2003 ). Рисунок 2 иллюстрирует образец, который можно увидеть, когда образцы несоответствующим образом лизируются. Нагревание образца во время инкубации в лизирующем агенте может увеличить лизис эритроцитов. Кроме того, встряхивание образца может усилить лизис эритроцитов.
Когда антитела поставляются в предварительно смешанном коктейле, который был проверен, мало беспокоит то, что неправильное антитело могло быть добавлено в окрашивающую пробирку. Однако, если антитела добавляются по отдельности, всегда существует вероятность того, что будет добавлено неправильное антитело или флуорохром. Это может быть трудно обнаружить, особенно в многоцветных многослойных ситуациях. Всякий раз, когда отмечается неожиданное окрашивание популяции, следует рассмотреть эту возможность. Проверка окрашивания всех популяций в выборке часто позволяет обнаружить эту проблему. Рисунок 5показывает пример, где правильное антитело (CD5), но неправильный флуорохром (PE-Cy5) было добавлено к образцу, что привело к ложной CD34-позитивной экспрессии на лимфоцитах. Ложная экспрессия CD34, наблюдаемое в этом примере, связано с тем, что между PE-Cy5 и APC требуется существенная коррекция перелива, которая не требовалась при использовании предполагаемого флуорохрома.
3 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ
Важно, чтобы перед тестированием образцов пациентов проточный цитометр был оптимально выровнен, трубки фотоумножителя были настроены для оптимального обнаружения сигнала, и выполнялась компенсация прибора, чтобы исключить появление нежелательного сигнала в канале, отличном от конкретного интересующего канала. Это достаточно простая проблема в 2 или 3 цветных окрасках; однако в 8–10 цветных окрасках это становится слишком сложным, чтобы делать это вручную, и требует, чтобы компьютерные алгоритмы отслеживали множественные области перекрытия сигналов. Рисунок 6a иллюстрирует значительный потенциал для неправильного сообщения о ненормальной популяции B-клеток с ограниченной легкой цепью, основанной на яркой экспрессии лямбда-PE, вызывающей ложно-положительное окрашивание (CD10 PE Texas Red) целевой популяции. Компенсация между двумя каналами установлена на уровне 72%. На рис. 6, б показан тот же образец с корректной компенсацией (увеличение компенсации на 1%). Обратите внимание, что «положительная» популяция теперь показана отрицательной, и у пациента есть поликлональные В-клетки.
Все современные проточные цитометры позволяют собирать «время» в качестве параметра. Это очень полезно в ситуациях, когда поток пробы может быть прерван (например, пузырьками в трубке) или когда образец высохнет. Если ввести «время», то область, в которой виден разрыв потока или конец цикла, можно легко исключить или «закрыть», чтобы оставить только те части анализа, которые не были затронуты нарушением потока. Рисунок 7a, b показывает влияние стробирования по временному параметру на образец костного мозга, который высыхает примерно через 400 с. Левый ряд графиков показывает значительные «осколки» как рассеяния света, так и флуоресценции. Когда временной интервал (верхний правый график) перемещается, чтобы исключить всплеск событий, а затем падение, данные из начальной части цикла сохраняются. Параметр номера события также может быть использован таким образом.
Многие образцы содержат клеточные дублеты. Они могут быть увеличены в недостаточно дезагрегированных образцах ткани и в некоторых В-клеточных злокачественных опухолях и могут быть увеличены, когда используются более высокие скорости потока. Проточный цитометр может обнаруживать дублеты на основе различий в рассеивании света, где дублеты могут иметь ту же общую флуоресценцию, что и большая ячейка, амплитуда сигнала будет отличаться между ними, как и время полета (TOF). Посредством построения графика прямой рассеяния в зависимости от прямой амплитуды (высоты) или TOF довольно легко обнаружить и исключить дублеты из анализа. На рисунке 8a показан пример, в котором дублеты могут создавать аномальную популяцию, экспрессирующую CD19 и CD5 (Keeney, Hedley, & Chin-Yee, 2017 ). После удаления дублета популяция, экспрессирующая CD19 и CD5, больше не присутствует (рис. 8, б).
При работе с образцами с очень небольшим количеством ячеек, например, CSF, или при выполнении минимального остаточного обнаружения (MRD), важно, чтобы прибор был чистым (например, чистящая панель или пустая пробирка должна быть запущена до образца) и чтобы не является переносом из предыдущего образца, который может выглядеть как ложноположительная популяция (Craig, Ohori, Gorrill, & Swerdlow, 2011 ).
Наконец, когда пробы запускаются на проточном цитометре, обычной практикой является использование заранее определенных протоколов с предварительно выбранными комбинациями антител, чтобы упростить анализ как во время, так и в автономном режиме после сбора данных. Если выбранный протокол не соответствует применяемым комбинациям антител и флуорохрома, существует вероятность неправильной характеристики популяции клеток. Всегда проверка образцов окрашивания остаточных нормальных популяций является одним из способов обнаружить это.
4 ВОПРОСА ИНТЕРПРЕТАЦИИ ДАННЫХ
После проверки потенциальных преаналитических и аналитических переменных для обеспечения высококачественных проточных цитометрических данных необходимо учитывать несколько факторов для достижения точной и последовательной интерпретации данных.
Основа ПЦ для распознавания гематопоэтической неоплазии основана на том принципе, что аномальные клетки, включающие гематопоэтическое новообразование, отличаются по иммунофенотипу от нормальных аналогов, что позволяет распознавать неопластические гематопоэтические клетки методом проточной цитометрии (Craig & Foon, 2008 ). Следует отметить, что иммунофенотип, связанный с нормальным кроветворением, не является статичным и характеризуется сдвигами в экспрессии антигена, которые происходят во время созревания и с различными состояниями активации (Li, Juco, Mann & Holden, 2004 ; McKenna, Washington, Aquino, Picker, & Kroft, 2001 ; van Lochem et al., 2004 ; Wood, 2016 ). Характер экспрессии антигена, связанный с нормальными гемопоэтическими клетками, также может варьироваться в зависимости от типа образца.
Неопластические популяции могут напоминать состояние созревания или активации, но будут демонстрировать аберрантные иммунофенотипические паттерны, отсутствующие при нормальных обстоятельствах. Экспрессия антигена может быть увеличена, уменьшена или отсутствует по сравнению с нормальным аналогом. Кроме того, аномальные популяции могут экспрессировать антиген, обычно не экспрессируемый на какой-либо стадии нормального развития (например, экспрессия нелинейного антигена или сверхэкспрессия онкогена). Таким образом, основа для интерпретации данных проточной цитометрии для идентификации кроветворных новообразований в значительной степени опирается на глубокое понимание нормальных иммунофенотипических паттернов. Рисунок 10 характеризует несколько примеров экспрессии антигена в лимфоидных новообразованиях с акцентом на то, как эти паттерны отличаются от нормальных аналогов.
Поскольку популяции опухолей характеризуются аберрантными физическими и иммунофенотипическими свойствами, эти популяции могут уклоняться от типичных стратегий гейтирования. Лимфоидные гейты, основанные на прямом и SSC или CD45 против SSC свойствах, могут быть общей отправной точкой для идентификации лимфоидных популяций. Хотя эта стратегия будет эффективна при выявлении большинства лимфоидных новообразований от маленького до среднего размера, крупноклеточная лимфома (и волосатоклеточный лейкоз) может иметь улучшенные рассеивающие свойства, удаляя часть или всю опухолевую популяцию из стандартных лимфоидных гейтов (рис. 11).). Точно так же бластные гейты, определяемые CD45 и SSC, часто являются отправной точкой для выявления аномальных предшественников при оценке образца для острого лейкоза; однако, острый промиелоцитарный лейкоз, как правило, демонстрирует повышенную SSC, часто удаляя большую часть опухолевой популяции из стандартного CD45 по сравнению с SSC-определенными бластными гейтами. В таких случаях опухолевая популяция может чрезмерно гранулоцитарной популяции в проекции CD45 против SSC. Подобно тому, как физические свойства могут изменяться в опухолевых популяциях, экспрессия антигена может изменяться и мешать стандартным стратегиям стробирования. Двумя часто встречающимися примерами этого явления являются лимфобластный лейкоз / лимфома, которые могут быть отрицательными для CD45 и избегать стандартного CD45 в сравнении с SSC-определенными бластными гейтами и новообразованиями Т-клеток, который может показывать отсутствие или снижение интенсивности одного или нескольких Т-клеточных антигенов, включая в некоторых случаях CD3. Поскольку свойства разброса, CD45 и маркеры происхождения могут использоваться для стробирования, очень важно не ограничивать поиск неопластической популяции одной популяцией, а скорее оценивать данные дополнительными способами, используя более одного параметра и прогноз для идентификации населения. Например, при оценке на острый лейкоз не ограничивайте поиск предшественников или бластов CD45 в сравнении с SSC-определенными бластными гейтами, а скорее рассматривайте все клетки в образце, используя несколько маркеров, которые могут быть экспрессированы популяцией предшественников. Точно так же, хотя оценка Т-клеток может начинаться с оценки лимфоидных клеток, экспрессирующих маркеры, включая CD3,
Дополнительным предостережением, которое следует учитывать при интерпретации данных проточной цитометрии, является наблюдение, что негематопоэтические новообразования могут иногда экспрессировать гематопоэтические маркеры. Например, CD56 обычно экспрессируется в солидных опухолях, происходящих из эпителия (Chu, Arber, & Weiss, 2003 ). Поскольку в некоторых случаях при негематопоэтических новообразованиях можно наблюдать экспрессию одного или нескольких гематопоэтических антигенов, следует проявлять осторожность при интерпретации данных, а данные проточной цитометрии следует рассматривать в соответствующем клиническом и морфологическом контексте.
Важно признать, что нормальные паттерны не являются статичными и могут изменить настройку терапии. Способ изменения экспрессии антигена зависит от типа проводимой терапии и временного интервала с момента самой последней терапии. По этой причине крайне важно интерпретировать данные проточной цитометрии в соответствующем терапевтическом контексте. Например, традиционные химиотерапевтические схемы лечения острого лейкоза могут привести к неспецифическому уничтожению быстро делящихся клеток, что приводит к панцитопении и общему снижению клеточности образцов, таких как костный мозг или кровь, в дни и недели после терапии. В зависимости от интенсивности проводимой терапии можно увидеть различия в количестве и качестве нормальных регенерирующих популяций предшественников в разные моменты времени (Рисунок 12). Таргетная терапия обычно используется отдельно или в комбинации при различных гематопоэтических новообразованиях. Нормальные паттерны, встречающиеся у пациентов, получающих целевую терапию, могут сильно отличаться от паттернов регенерации костного мозга в условиях обычной терапии. Рисунок 12 иллюстрирует паттерны, наблюдаемые у пациентов с B-LL, которые получали различные целевые терапии. Такая целевая терапия не только изменяет паттерны нормальных фоновых клеток, но также может изменять иммунофенотип опухолевой популяции (рис. 13).). Часто встречающееся явление — потеря целевого антигена в опухолевой популяции. Это может иметь значение для выявления остаточных заболеваний. Например, CD19 экспрессируется на большинстве нормальных В-клеток на всех стадиях созревания, а также на большинстве незрелых и зрелых новообразований В-клеток. Эта особенность обычно делает CD19 и отличным стробирующим реагентом для идентификации как нормальных популяций B-клеток, так и новообразований B-клеток. Однако полезность этого реагента снижается при назначении методов лечения, нацеленных на этот антиген, так как рецидивы после терапии могут быть CD19-отрицательными.
Наконец, в условиях высокочувствительных анализов со сбором большого количества событий, а также в ситуациях, когда стратегии гейтирования изменяются, можно найти «новые группы населения», которые являются нормальными, но не видны при использовании знакомых стратегий гейтирования и когда меньшее количество события собраны. Один пример этого встречается при использовании CD45 против SSC-определенных доменных гейтов для идентификации предшественников. В то время как многие популяции бластов попадают в этот регион, другие популяции занимают «бластные гейты», которые не являются прародителями. Например, плазмоцитоидные дендритные клетки и базофилы занимают типичные CD45-определяемые SSC «бластные гейты». Эти популяции могут не быть легко идентифицированы, когда существует пропорционально большая популяция предшественников и / или относительно меньшее количество событий собрано. В настройках MRD, когда собирается большое количество событий, такие популяции становятся более очевидными и их не следует принимать за аномальные взрывы. Такие группы населения должны быть специально определены, чтобы избежать ошибочной идентификации как взрывов. В случае плазмоцитоидных дендритных клеток и базофилов обе популяции являются строго положительными в отношении CD123, что позволяет уверенно отделяться от нормальных и аномальных предшественников в большинстве случаев (рис.14 а). Включение реагентов для конкретной идентификации таких популяций желательно при рассмотрении конструкции панели. При сборе большого количества событий, как в случае MRD, можно встретить необычные паттерны экспрессии антигена, которые могут запутать анализ. Например, было описано, что небольшая часть естественных клеток-киллеров (NK) экспрессирует CD19 или CD117 низкого уровня (Montaldo et al., 2013 ; Soma et al., 2015) ). Хотя это открытие не представляет проблемы в стандартном анализе, NK-клетки, экспрессирующие CD19 или CD117, могут мешать анализу MRD в условиях B-LL или острого миелоидного лейкоза соответственно. Наконец, изменения в стратегии гейтирования могут иногда выявлять новые, ранее непризнанные, нормальные группы населения. Один из примеров этого явления показан на рисунке 14 d – f. В этом примере переход от использования CD19 для идентификации B-клеток к использованию стратегии, использующей комбинацию экспрессии CD22 или CD24 (Cherian et al., 2018 ), привел к идентификации дополнительных CD34-позитивных предшественников, у которых отсутствовал CD19 и которые следует различать из CD19- отрицательных аберрантных групп населения.
5. ВЫВОДЫ
ПЦ является мощным инструментом для характеристики кроветворных клеток и играет важную роль в диагностике и классификации многих гематопоэтических новообразований, а также некоторых неопухолевых состояний. Полное понимание потенциальных ловушек, которые могут возникнуть на доаналитической и аналитической стадиях, включая подготовку образцов, сбор данных и интерпретацию данных, является критическим элементом, необходимым для получения высококачественных данных проточной цитометрии.