что такое проточная цитометрия

ТОМ 4, СТ. 131 (стр. 465-470) //

ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ
АНАЛИЗ ИЗОБРАЖЕНИЯ. ПОЛУЧЕНИЕ И ПРЕДСТАВЛЕНИЕ ДАННЫХ

Е.Е.Зуева *
Санкт-Петербургский Медицинский Университет им. акад. И.П.Павлова, Санкт-Петербург, Российская Федерация

Резюме
Иммунофенотипирование клеток крови и костного мозга человека традиционно осуществляется методом проточной цитометрии и позволяет оценивать экспрессию нескольких маркеров одновременно. Использование многоцветного окрашивания требует корректной оценки получаемого изображения. Рассмотрены варианты коэкспрессии маркеров при проведении трехцветного окрашивания. Показана возможность оценки гетерогенности экспрессии маркеров на клетках одной популяции при анализе изображения в пространстве двумерной гистограммы.

Ключевые слова: иммунофенотипирование, проточная цитометрия, анализ изображения

Учет результатов
Анализ антигенной экспрессии осуществляется на проточном цитометре с использованием программного обеспечения для анализа больших массивов данных. Возбуждение флюоресценции происходит при прохождении клеткой фокального пятна аргонового лазера, охлаждаемого воздухом (мощность 15 mW, испускаемая длина волны 488 нм). Учет флюоресценции осуществляется при 512-547 нм, 572-591 нм и более 610 нм для FITC, PE и PerCP/PE-Cy5 каналов флюоресценции на первом (FL1), втором (FL2) и третьем (FL3) фотоумножителях соответственно. Таким образом, получают данные по прямому (FSC) и боковому (SSC) светорассеянию, а также по флюоресценции клеток, связавших флюорохром-конъюгированные антитела. Компенсация наложения флюоресценции осуществляется средствами программного обеспечения. Позитивность окрашивания с любым антителом оценивается при наложении квадрантов, определенных отрицательным изотипическим контролем.

Представление данных
Данные по прямому и боковому светорассеянию исследуемых клеток отражают на двумерных гистограммах FSC/SSC (прямое forward side scatter (FSC) и угловое side scatter (SSC) светорассеяние). Для сигнала по FSC и SSC обычно используют линейное усиление, сигналы флюоресценции могут быть усилены до четырех (пяти) декадной логарифмической шкалы. Логическое ограничение лимфоцитарного гейта определяется по нижнему и верхнему значению лимфоцитарного пика на одномерной гистограмме и применяется к двумерным гистограммам. Моноцитарный гейт касается лимфоцитарного гейта с превышением значения SSC в полтора раза. Гранулоцитарный гейт касается моноцитарного гейта и распространяется вверх по всей оси SSC. Левая и правая границы моноцитарного и гранулоцитарного кластеров определены по соответствующим пикам на одномерных гистограммах. При использовании одноцветного анализа с различными флюорохромами сигналы фотоумножителей FL1, FL2 и FL3 отражены на одномерных четырехдекадных гистограммах. При использовании многоцветного анализа данные по каналам флюоресценции отражены на двумерных четырех декадных log/log гистограммах (FL1/ FL2, FL2/ FL3 и FL3/ FL1). Квадранты в этих гистограммах (FL1/ FL2 (FITC/PE), FL2/ FL3 (PE/PerCP) и FL3/ FL1 (PerCP/FITC)) определяют две разделительные линии, фиксированные для всех измерений на одной четверти шкалы флюоресценции по абсциссе и ординате. Для анализа малоклеточных популяций могут быть также использованы смешанные линейно-логарифимированные гистограммы SSC/FL(1-3).

Анализ данных
Анализ данных заключается в определении положения кластера клеток в многомерном пространстве проточной цитометрии. При выявлении на двумерной гистограмме Fl2/Fl1 кластера событий, позитивного по обоим маркерам, использование трехцветной метки позволяет получить четыре варианта экспрессии третьего маркера (рис.1.)

При одновременном использовании трех антител возможно получение восьми комбинаций положительных и отрицательных популяций (табл1),

расположение которых в пространстве трех четырехдекадных гистограмм (FL1/Fl2, Fl2/Fl3, Fl3/Fl1) строго определено (рис.2).

Варианты сочетанной экспрессии (бинарный вариант). Варианты сочетанной экспрессии маркеров при трехцветном окрашивании. При совместном использовании трех антител возможно получение восьми комбинаций положительных и отрицательных популяций в пространстве трех двумерных гистограмм. Буквенные обозначения аналогичны табл. 1.

Такое изображение может быть получено при гомогенном характере экспрессии, т.е. в том случае, если все клетки популяции однородно экспрессируют каждый анализируемый маркер.

Анализ коэкспрессии маркеров
Далеко не во всех случаях, популяция, позитивная по экспрессии одного маркера, также однородно экспрессирует другой маркер. Для оценки гетерогенности экспрессии маркеров на клетках одной популяции может быть использована схема изображения возможных вариантов коэкспрессии в пространстве двумерной гистограммы (рис.3).

Фактически на двумерной гистограмме может быть представлено всего несколько вариантов коэкспрессии маркеров.

* Адрес для переписки: Зуева Екатерина Евгеньевна, с.н.с. лаборатории молекулярной диагностики Научно-методического центра по молекулярной медицине СПбГМУ им. акад.И.П.Павлова, ул. Л.Толстого, 6/8, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197089. Тел/факс: +7 812-2387194, e-mail: dinzu@mail.ru

1 Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Под ред. С.Херрингтона и Дж. Магки, М.,Мир, 1999, 506 стр.

2 Horsburg T., S. Martin, A.J.Robson The application of flow cytometry to histocompatibility testing. Transplant Immunology 2000, 8 (1):3-15.

3 Gelman R., Wilkening C. Analyses of quality assessment studies using CD45 for gating lymphocytes for CD3+CD4+%. Cytometry (Comm in Clin Cytometry) 2000; 42:1-4.

4 Gratama JW, Sutherland DR, Keeney M, Papa S. Flow cytometric enumeration and immunophenotyping of hematopoietic stem and progenitor cells. J Biol Regul Homeost Agents 2001;15:14-22.

5 Hrusak O., Porwit-MacDonald A. Antigen expression patterns reflecting enotype of acute leukemias. Leukemia 2002; 16:1233-1258.

6 Cualing HD. Automated analysis in flow cytometry. Cytometry. 2000 Apr 15;42(2):110-3

Источник

Что такое проточная цитометрия

Подводные камни проточной цитометрии в диагностической гематопатологии

Аннотация

Проточная цитометрия (ФК) оказалась чрезвычайно универсальным и полезным инструментом для диагностики и мониторинга гематологических заболеваний в дополнение ко многим другим применениям. Значительные достижения в области электроники, программного обеспечения и реагентов за последние годы упростили некоторые аспекты ФК, в то же время способность комбинировать 8–10 антител в одной пробирке может создать как технические, так и интерпретационные проблемы, которые труднее обнаружить при использовании только 3–4 цветовых комбинаций. Использование многопараметрических панелей может облегчить идентификацию аномальных популяций; Однако характеристики опухолевого населения могут создавать потенциальные диагностические ошибки. Понимание нормальных иммунофенотипических паттернов в состоянии покоя, восстановления, и активация является критическим первым шагом для того, чтобы надлежащим образом идентифицировать аномальные популяции, которые характеризуют гематопоэтические новообразования. Кроме того, внедрение новых терапевтических стратегий, в частности таргетной терапии, может смешивать стандартные методы анализа данных проточной цитометрии, и знание влияния терапии на данные проточной цитометрии имеет решающее значение для точной интерпретации данных. В этой рукописи будут рассмотрены вопросы доаналитического анализа, инструментов и интерпретации, которые могут привести к неправильной интерпретации результатов.

2 ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

Образцы, полученные для ПЦ, должны быть проверены на наличие признаков плохого обращения после сбора. Например, свернутые или гемолизированные образцы могут не отражать исследуемого состояния заболевания. Образцы, загрязненные периферической кровью, показывают увеличенное количество зрелых гранулоцитов, и это должно быть отмечено в окончательном отчете. Жизнеспособность часто вызывает беспокойство, когда образцы ткани собирают, и по этой причине их следует помещать в консервирующую среду [например, среду 199 или среду Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640] сразу после сбора. Все образцы должны быть оценены на жизнеспособность. В большинстве лабораторий график прямого рассеяния в зависимости от бокового рассеяния (SSC) используется для исключения мусора и получения грубой оценки жизнеспособности. Один метод, используемый в некоторых лабораторных условиях, в частности, при оценке образцов тканей следует включать в анализ образцов жизнеспособный краситель (например, 7AAD или амино-реактивные флуоресцентные красители). Такие красители могут быть добавлены к образцу и проанализированы с помощью FC, чтобы обеспечить точную оценку качества исследуемого материала. Образцы тканей, отправляемые в реферальные лаборатории, часто могут извлечь выгоду из использования флуоресцентных красителей жизнеспособности, поскольку дегенеративные клетки могут быть трудно исключить только с помощью рассеяния света. Преимущества такого удаления достигаются за счет уменьшения максимального количества антигенов, доступных для данной пробирки. Лаборатория, обрабатывающая только периферическую кровь из собственного учреждения, может посчитать использование красителя жизнеспособности менее важным, чем региональная или национальная референс-лаборатория, которая получила большое количество образцов ткани. Как правило, образцы либо промывают, окрашивают, и затем добавляют буфер для лизиса, или образцы можно окрашивать, лизировать и затем промывать. Для обнаружения поверхностного иммуноглобулина важно, чтобы образцы были промыты минимум два раза в физиологическом растворе с фосфатным буфером перед окрашиванием для удаления цитофильных антител. фигураНа фиг.1 показано влияние увеличения степени промывки на отделение поверхностного окрашивания каппа и лямбда в образце крови. В случаях, когда встречаются необычные или неожиданные схемы окрашивания, промывка для удаления компонентов плазмы может улучшить качество данных. Кроме того, некоторые клоны антител могут быть более восприимчивыми к таким взаимодействиям (Wood & Levin, 2006 ).

Некоторые образцы могут демонстрировать устойчивость к лизису эритроцитов (RBC) в зависимости от болезненного состояния пациентов или лекарственной терапии (Kasinrerk, 2003 ). Рисунок 2 иллюстрирует образец, который можно увидеть, когда образцы несоответствующим образом лизируются. Нагревание образца во время инкубации в лизирующем агенте может увеличить лизис эритроцитов. Кроме того, встряхивание образца может усилить лизис эритроцитов.

Когда антитела поставляются в предварительно смешанном коктейле, который был проверен, мало беспокоит то, что неправильное антитело могло быть добавлено в окрашивающую пробирку. Однако, если антитела добавляются по отдельности, всегда существует вероятность того, что будет добавлено неправильное антитело или флуорохром. Это может быть трудно обнаружить, особенно в многоцветных многослойных ситуациях. Всякий раз, когда отмечается неожиданное окрашивание популяции, следует рассмотреть эту возможность. Проверка окрашивания всех популяций в выборке часто позволяет обнаружить эту проблему. Рисунок 5показывает пример, где правильное антитело (CD5), но неправильный флуорохром (PE-Cy5) было добавлено к образцу, что привело к ложной CD34-позитивной экспрессии на лимфоцитах. Ложная экспрессия CD34, наблюдаемое в этом примере, связано с тем, что между PE-Cy5 и APC требуется существенная коррекция перелива, которая не требовалась при использовании предполагаемого флуорохрома.

3 АНАЛИТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

Важно, чтобы перед тестированием образцов пациентов проточный цитометр был оптимально выровнен, трубки фотоумножителя были настроены для оптимального обнаружения сигнала, и выполнялась компенсация прибора, чтобы исключить появление нежелательного сигнала в канале, отличном от конкретного интересующего канала. Это достаточно простая проблема в 2 или 3 цветных окрасках; однако в 8–10 цветных окрасках это становится слишком сложным, чтобы делать это вручную, и требует, чтобы компьютерные алгоритмы отслеживали множественные области перекрытия сигналов. Рисунок 6a иллюстрирует значительный потенциал для неправильного сообщения о ненормальной популяции B-клеток с ограниченной легкой цепью, основанной на яркой экспрессии лямбда-PE, вызывающей ложно-положительное окрашивание (CD10 PE Texas Red) целевой популяции. Компенсация между двумя каналами установлена ​​на уровне 72%. На рис. 6, б показан тот же образец с корректной компенсацией (увеличение компенсации на 1%). Обратите внимание, что «положительная» популяция теперь показана отрицательной, и у пациента есть поликлональные В-клетки.

Все современные проточные цитометры позволяют собирать «время» в качестве параметра. Это очень полезно в ситуациях, когда поток пробы может быть прерван (например, пузырьками в трубке) или когда образец высохнет. Если ввести «время», то область, в которой виден разрыв потока или конец цикла, можно легко исключить или «закрыть», чтобы оставить только те части анализа, которые не были затронуты нарушением потока. Рисунок 7a, b показывает влияние стробирования по временному параметру на образец костного мозга, который высыхает примерно через 400 с. Левый ряд графиков показывает значительные «осколки» как рассеяния света, так и флуоресценции. Когда временной интервал (верхний правый график) перемещается, чтобы исключить всплеск событий, а затем падение, данные из начальной части цикла сохраняются. Параметр номера события также может быть использован таким образом.

Многие образцы содержат клеточные дублеты. Они могут быть увеличены в недостаточно дезагрегированных образцах ткани и в некоторых В-клеточных злокачественных опухолях и могут быть увеличены, когда используются более высокие скорости потока. Проточный цитометр может обнаруживать дублеты на основе различий в рассеивании света, где дублеты могут иметь ту же общую флуоресценцию, что и большая ячейка, амплитуда сигнала будет отличаться между ними, как и время полета (TOF). Посредством построения графика прямой рассеяния в зависимости от прямой амплитуды (высоты) или TOF довольно легко обнаружить и исключить дублеты из анализа. На рисунке 8a показан пример, в котором дублеты могут создавать аномальную популяцию, экспрессирующую CD19 и CD5 (Keeney, Hedley, & Chin-Yee, 2017 ). После удаления дублета популяция, экспрессирующая CD19 и CD5, больше не присутствует (рис. 8, б).

При работе с образцами с очень небольшим количеством ячеек, например, CSF, или при выполнении минимального остаточного обнаружения (MRD), важно, чтобы прибор был чистым (например, чистящая панель или пустая пробирка должна быть запущена до образца) и чтобы не является переносом из предыдущего образца, который может выглядеть как ложноположительная популяция (Craig, Ohori, Gorrill, & Swerdlow, 2011 ).

Наконец, когда пробы запускаются на проточном цитометре, обычной практикой является использование заранее определенных протоколов с предварительно выбранными комбинациями антител, чтобы упростить анализ как во время, так и в автономном режиме после сбора данных. Если выбранный протокол не соответствует применяемым комбинациям антител и флуорохрома, существует вероятность неправильной характеристики популяции клеток. Всегда проверка образцов окрашивания остаточных нормальных популяций является одним из способов обнаружить это.

4 ВОПРОСА ИНТЕРПРЕТАЦИИ ДАННЫХ

После проверки потенциальных преаналитических и аналитических переменных для обеспечения высококачественных проточных цитометрических данных необходимо учитывать несколько факторов для достижения точной и последовательной интерпретации данных.

Основа ПЦ для распознавания гематопоэтической неоплазии основана на том принципе, что аномальные клетки, включающие гематопоэтическое новообразование, отличаются по иммунофенотипу от нормальных аналогов, что позволяет распознавать неопластические гематопоэтические клетки методом проточной цитометрии (Craig & Foon, 2008 ). Следует отметить, что иммунофенотип, связанный с нормальным кроветворением, не является статичным и характеризуется сдвигами в экспрессии антигена, которые происходят во время созревания и с различными состояниями активации (Li, Juco, Mann & Holden, 2004 ; McKenna, Washington, Aquino, Picker, & Kroft, 2001 ; van Lochem et al., 2004 ; Wood, 2016 ). Характер экспрессии антигена, связанный с нормальными гемопоэтическими клетками, также может варьироваться в зависимости от типа образца.

Неопластические популяции могут напоминать состояние созревания или активации, но будут демонстрировать аберрантные иммунофенотипические паттерны, отсутствующие при нормальных обстоятельствах. Экспрессия антигена может быть увеличена, уменьшена или отсутствует по сравнению с нормальным аналогом. Кроме того, аномальные популяции могут экспрессировать антиген, обычно не экспрессируемый на какой-либо стадии нормального развития (например, экспрессия нелинейного антигена или сверхэкспрессия онкогена). Таким образом, основа для интерпретации данных проточной цитометрии для идентификации кроветворных новообразований в значительной степени опирается на глубокое понимание нормальных иммунофенотипических паттернов. Рисунок 10 характеризует несколько примеров экспрессии антигена в лимфоидных новообразованиях с акцентом на то, как эти паттерны отличаются от нормальных аналогов.

Поскольку популяции опухолей характеризуются аберрантными физическими и иммунофенотипическими свойствами, эти популяции могут уклоняться от типичных стратегий гейтирования. Лимфоидные гейты, основанные на прямом и SSC или CD45 против SSC свойствах, могут быть общей отправной точкой для идентификации лимфоидных популяций. Хотя эта стратегия будет эффективна при выявлении большинства лимфоидных новообразований от маленького до среднего размера, крупноклеточная лимфома (и волосатоклеточный лейкоз) может иметь улучшенные рассеивающие свойства, удаляя часть или всю опухолевую популяцию из стандартных лимфоидных гейтов (рис. 11).). Точно так же бластные гейты, определяемые CD45 и SSC, часто являются отправной точкой для выявления аномальных предшественников при оценке образца для острого лейкоза; однако, острый промиелоцитарный лейкоз, как правило, демонстрирует повышенную SSC, часто удаляя большую часть опухолевой популяции из стандартного CD45 по сравнению с SSC-определенными бластными гейтами. В таких случаях опухолевая популяция может чрезмерно гранулоцитарной популяции в проекции CD45 против SSC. Подобно тому, как физические свойства могут изменяться в опухолевых популяциях, экспрессия антигена может изменяться и мешать стандартным стратегиям стробирования. Двумя часто встречающимися примерами этого явления являются лимфобластный лейкоз / лимфома, которые могут быть отрицательными для CD45 и избегать стандартного CD45 в сравнении с SSC-определенными бластными гейтами и новообразованиями Т-клеток, который может показывать отсутствие или снижение интенсивности одного или нескольких Т-клеточных антигенов, включая в некоторых случаях CD3. Поскольку свойства разброса, CD45 и маркеры происхождения могут использоваться для стробирования, очень важно не ограничивать поиск неопластической популяции одной популяцией, а скорее оценивать данные дополнительными способами, используя более одного параметра и прогноз для идентификации населения. Например, при оценке на острый лейкоз не ограничивайте поиск предшественников или бластов CD45 в сравнении с SSC-определенными бластными гейтами, а скорее рассматривайте все клетки в образце, используя несколько маркеров, которые могут быть экспрессированы популяцией предшественников. Точно так же, хотя оценка Т-клеток может начинаться с оценки лимфоидных клеток, экспрессирующих маркеры, включая CD3,

Дополнительным предостережением, которое следует учитывать при интерпретации данных проточной цитометрии, является наблюдение, что негематопоэтические новообразования могут иногда экспрессировать гематопоэтические маркеры. Например, CD56 обычно экспрессируется в солидных опухолях, происходящих из эпителия (Chu, Arber, & Weiss, 2003 ). Поскольку в некоторых случаях при негематопоэтических новообразованиях можно наблюдать экспрессию одного или нескольких гематопоэтических антигенов, следует проявлять осторожность при интерпретации данных, а данные проточной цитометрии следует рассматривать в соответствующем клиническом и морфологическом контексте.

Важно признать, что нормальные паттерны не являются статичными и могут изменить настройку терапии. Способ изменения экспрессии антигена зависит от типа проводимой терапии и временного интервала с момента самой последней терапии. По этой причине крайне важно интерпретировать данные проточной цитометрии в соответствующем терапевтическом контексте. Например, традиционные химиотерапевтические схемы лечения острого лейкоза могут привести к неспецифическому уничтожению быстро делящихся клеток, что приводит к панцитопении и общему снижению клеточности образцов, таких как костный мозг или кровь, в дни и недели после терапии. В зависимости от интенсивности проводимой терапии можно увидеть различия в количестве и качестве нормальных регенерирующих популяций предшественников в разные моменты времени (Рисунок 12). Таргетная терапия обычно используется отдельно или в комбинации при различных гематопоэтических новообразованиях. Нормальные паттерны, встречающиеся у пациентов, получающих целевую терапию, могут сильно отличаться от паттернов регенерации костного мозга в условиях обычной терапии. Рисунок 12 иллюстрирует паттерны, наблюдаемые у пациентов с B-LL, которые получали различные целевые терапии. Такая целевая терапия не только изменяет паттерны нормальных фоновых клеток, но также может изменять иммунофенотип опухолевой популяции (рис. 13).). Часто встречающееся явление — потеря целевого антигена в опухолевой популяции. Это может иметь значение для выявления остаточных заболеваний. Например, CD19 экспрессируется на большинстве нормальных В-клеток на всех стадиях созревания, а также на большинстве незрелых и зрелых новообразований В-клеток. Эта особенность обычно делает CD19 и отличным стробирующим реагентом для идентификации как нормальных популяций B-клеток, так и новообразований B-клеток. Однако полезность этого реагента снижается при назначении методов лечения, нацеленных на этот антиген, так как рецидивы после терапии могут быть CD19-отрицательными.

Наконец, в условиях высокочувствительных анализов со сбором большого количества событий, а также в ситуациях, когда стратегии гейтирования изменяются, можно найти «новые группы населения», которые являются нормальными, но не видны при использовании знакомых стратегий гейтирования и когда меньшее количество события собраны. Один пример этого встречается при использовании CD45 против SSC-определенных доменных гейтов для идентификации предшественников. В то время как многие популяции бластов попадают в этот регион, другие популяции занимают «бластные гейты», которые не являются прародителями. Например, плазмоцитоидные дендритные клетки и базофилы занимают типичные CD45-определяемые SSC «бластные гейты». Эти популяции могут не быть легко идентифицированы, когда существует пропорционально большая популяция предшественников и / или относительно меньшее количество событий собрано. В настройках MRD, когда собирается большое количество событий, такие популяции становятся более очевидными и их не следует принимать за аномальные взрывы. Такие группы населения должны быть специально определены, чтобы избежать ошибочной идентификации как взрывов. В случае плазмоцитоидных дендритных клеток и базофилов обе популяции являются строго положительными в отношении CD123, что позволяет уверенно отделяться от нормальных и аномальных предшественников в большинстве случаев (рис.14 а). Включение реагентов для конкретной идентификации таких популяций желательно при рассмотрении конструкции панели. При сборе большого количества событий, как в случае MRD, можно встретить необычные паттерны экспрессии антигена, которые могут запутать анализ. Например, было описано, что небольшая часть естественных клеток-киллеров (NK) экспрессирует CD19 или CD117 низкого уровня (Montaldo et al., 2013 ; Soma et al., 2015) ). Хотя это открытие не представляет проблемы в стандартном анализе, NK-клетки, экспрессирующие CD19 или CD117, могут мешать анализу MRD в условиях B-LL или острого миелоидного лейкоза соответственно. Наконец, изменения в стратегии гейтирования могут иногда выявлять новые, ранее непризнанные, нормальные группы населения. Один из примеров этого явления показан на рисунке 14 d – f. В этом примере переход от использования CD19 для идентификации B-клеток к использованию стратегии, использующей комбинацию экспрессии CD22 или CD24 (Cherian et al., 2018 ), привел к идентификации дополнительных CD34-позитивных предшественников, у которых отсутствовал CD19 и которые следует различать из CD19- отрицательных аберрантных групп населения.

5. ВЫВОДЫ

ПЦ является мощным инструментом для характеристики кроветворных клеток и играет важную роль в диагностике и классификации многих гематопоэтических новообразований, а также некоторых неопухолевых состояний. Полное понимание потенциальных ловушек, которые могут возникнуть на доаналитической и аналитической стадиях, включая подготовку образцов, сбор данных и интерпретацию данных, является критическим элементом, необходимым для получения высококачественных данных проточной цитометрии.

Источник

• ← что такое мартышка электроинструмент
• кратко что такое генетический код →