что такое отжиг днк

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.

Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию

Словарь

Праймер – котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

Литература

ВАЖНО!

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Источник

Сколько стоит сдать ПЦР-анализ

Я пять лет работал в государственной медицинской лаборатории.

По опыту знаю, что пациентам бывает непросто разобраться с тем, какие тесты им нужно сдавать, да и нужно ли вообще. В этой статье расскажу, что такое ПЦР-анализы и можно ли на них сэкономить.

Сходите к врачу

Наши статьи написаны с любовью к доказательной медицине. Мы ссылаемся на авторитетные источники и ходим за комментариями к докторам с хорошей репутацией. Но помните: ответственность за ваше здоровье лежит на вас и на лечащем враче. Мы не выписываем рецептов, мы даем рекомендации. Полагаться на нашу точку зрения или нет — решать вам.

Что такое ПЦР-тесты и зачем их сдавать

В отличие от криминалистов, врачей обычно интересуют две вещи:

Но генетические анализы нужны не так уж часто, поэтому в статье мы будем говорить про ПЦР-анализы на инфекции.

Как работает ПЦР-анализ. У большинства живых существ на нашей планете, за исключением некоторых вирусов с РНК-геномами, генетический материал представляет собой длинную двухцепочечную молекулу ДНК.

Цепочка ДНК состоит из «звеньев» — нуклеотидов. Это четыре небольшие молекулы, строение которых универсально для всех живых существ. Из одного и того же набора нуклеотидов можно собрать геном вируса оспы, человека или синего кита. Вся разница — в порядке, в котором нуклеотиды идут в цепочке ДНК. Зная уникальный порядок нуклеотидов для участка ДНК какой-нибудь болезнетворной бактерии, мы можем засечь его присутствие в биологическом материале. А поскольку этот порядок уникален, мы не перепутаем его с человеческой ДНК.

Во время полимеразной цепной реакции кусочек чужеродного генетического материала из образца при помощи особого белка-фермента размножают много-много раз. В результате получается столько ДНК, что ее хватает для успешной идентификации.

Для каждого микроорганизма набор реактивов нужен свой. Поэтому врачи назначают не ПЦР-анализ вообще, а исследование на конкретный микроорганизм. Так что ПЦР-тест на гепатит С не поможет найти в образце еще и хламидии.

ПЦР-анализы бывают качественные и количественные. Качественные позволяют понять, есть ли в образце генетический материал бактерии или вируса, который мы ищем. А количественные — сколько именно там этого материала. Если сделать несколько таких тестов во время лечения, станет ясно, действует ли на микробов назначенное лекарство.

Как подготовиться к ПЦР-анализу

Чтобы выяснить, какая инфекция поразила человека, у него обычно берут кровь, мочу, образцы клеток слизистой из ротоглотки или с шейки матки.

В России кровь по умолчанию рекомендуется сдавать натощак, не менее чем с интервалом в 8—12 часов после приема пищи. Однако за рубежом таких строгих правил нет: считается, что перед походом в лабораторию можно позавтракать без сладкого и жирного, например кашей без сахара и масла, куриной грудкой или яйцом. Так что если у вас был легкий завтрак, кровь сдавать можно. Пить тоже не запрещено, но лучше ограничиться чистой водой без газа.

Если в качестве материала выступает моча, ее нужно собирать утром, как только проснетесь, в чистый контейнер для анализов или в вымытую с мылом банку из-под детского питания.

Правила, по которым нужно сдавать мазок на ПЦР из половых органов, отличаются для мужчин и для женщин. Всем за 1—2 дня до исследования нужно отказаться от секса, а в течение 1,5—2 часов перед исследованием — воздерживаться от мочеиспускания. Женщинам за сутки до процедуры не следует проводить спринцевание, пользоваться свечами и антисептиками для подмывания. Во время менструации сдавать биологический материал нельзя.

Можно ли верить ПЦР-тесту

Ни один лабораторный тест не обеспечивает абсолютной точности, всегда есть вероятность ошибки. Причем ошибиться тест может в обе стороны: либо не найти искомую инфекцию у пациента, которой он на самом деле заражен, либо обнаружить ее у человека, болеющего чем-то другим или вовсе здорового.

При этом ПЦР-анализы зачастую точнее других методов поиска возбудителя инфекционных заболеваний. Например, возбудителей гонореи у женщин можно искать под микроскопом, можно выращивать в чашке Петри, а можно определять методом ПЦР. В первом случае чувствительность анализа в пределах 36,2%, во втором — 89,7%, а в третьем — 89,9—100%. Получается, что ПЦР-анализ — самый надежный, и доверять ему можно. Примерно так же дела обстоят и с другими половыми инфекциями.

Информативность ПЦР в диагностике инфекций, передаваемых половым путемPDF, 152 КБ

Однако есть и относительно новые, менее надежные варианты ПЦР-тестов — например, на коронавирусную инфекцию. По словам Дениса Проценко, главного врача инфекционной больницы в Коммунарке, чувствительность тестов для выявления COVID-19 — 70—80%. Согласно китайским данным, чувствительность теста может быть еще ниже — в пределах 66—80%.

Но здесь многое зависит от времени взятия образца. Если мазок из горла взяли через 3—4 дня после появления симптомов, то вирус уже мог успеть спуститься из ротоглотки в легкие, и тогда вероятность найти его в мазке составляет всего 40%.

Хотя ПЦР-тесты на коронавирус работают хуже, чем ПЦР-тесты на половые инфекции, ничего точнее для диагностики коронавирусной болезни у нас пока нет. Врачи назначают повторный тест, если у них по результатам диагностики остаются сомнения.

Источник

Полимеразная цепная реакция

ПЦР – это способ, с помощью которого в лаборатории можно быстро получить большое количество копий ДНК. Ну, или РНК. С помощью ПЦР можно также находить преступников, диагностировать заболевания и определять отцовство, но об этом ниже.

Что требуется для ПЦР

1) ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который необходимо размножить (амплифицировать).

2) Два праймера, комплементарные противоположным концам противоположных цепей участка ДНК, который необходимо амплифицировать. (Если вы плохо представляете себе роль праймеров, то вам лучше сначала почитать предыдущую статью, посвященную репликации.)

3) ДНК-полимераза, которая синтезирует ДНК. Для ПЦР используют термостабильную полимеразу архей, живущих при 80°С – она не сваривается при нагревании.

Кроме того, требуются исходные вещества для синтеза ДНК – дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), ионы Mg2+ для работы полимеразы, буферный раствор и прочие биохимические украшения. Кидаем всё это в пробирку, помещаем её в специальный прибор амплификатор и нажимаем кнопку Пуск.

Денатурация 90-96°C
Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 95°C на 1-2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись (при нагревании разрушаются водородные связи между азотистыми основаниями цепей ДНК).

Отжиг 50-70°C
Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

Элонгация 70-72°C
ДНК-полимераза производит синтез второй цепи ДНК от 3′-конца праймера, который связался с матрицей. Элонгацию проводят при температуре наибольшей активности термостабильной полимеразы (72°C) в течение 1-3 минут.

Соответственно, праймеров тоже нужно очень много,
а не «два», как написано над рисунком. Смотрите: уже для первого цикла надо 2 праймера, для второго надо еще 4, для третьего еще 8 и т.д. Фактически, прежде чем копировать участок ДНК, надо накопировать множество праймеров (тоже участков ДНК). Как это делается? – Ответ будет дан на следующем факультативе.

Как с помощью ПЦР диагностировать инфекционные заболевания

Представим себе человека, который заразился энцефалитом. Ну, или СПИДом – веселого, в любом случае, мало. (От энцефалита существуют прививки, от СПИДа – презервативы, на этом наш воспитательный классный час окончен, до свидания.)

На ранней стадии очень многие инфекционные болезни похожи на обычный грипп: высокая температура, боль в мышцах и суставах, недомогание; при СПИДе (в самом его начале) ещё и горло болит. Явственных признаков конкретной болезни пока еще нет – только стандартное воспаление. Но ДНК (РНК) вируса уже есть в крови человека, и её можно определить с помощью ПЦР уже на 10 день после заражения – это самый ранний способ определения.

Для теста на СПИД методом ПЦР берут кровь человека, выделяют из клеток множество разных молекул РНК (ВИЧ – РНК-содержащий вирус), проводят их обратную транскрипцию (получают ДНК), а потом пытаются найти среди них ДНК ВИЧа путем ПЦР: добавляют праймеры, комплементарные ДНК ВИЧ и амплифицируют часок-другой. Если после этого в пробирке оказывается очень много ДНК, значит ДНК-матрица для ВИЧ-праймеров в пробе была, человек заражён. Если в пробирке оказываются одни лишь дезоксирибонуклеозидтрифосфаты – пока здоров.

Как с помощью ПЦР находят преступников
(ДНК-дактилоскопия)

В качестве маркёров для ДНК-дактилоскопии обычно используют микросателлиты – участки ДНК, состоящие из множества коротких повторов. Под «коротким повтором» имеется в виду что-нибудь типа AATG. Эти конкретные четыре буковки (микросателлит TPOX) могут повторяться в ДНК человека от 4 до 16 раз: например, у вас они повторяются 10 раз, а у вашего соседа по парте – 7 раз. В стандартном случае проводят анализ на 6-13 повторов (это 8 наиболее часто встречающихся аллелей).

Что нам понадобится для анализа этой последовательности в домашних условиях? Сверяемся с началом статьи:
1) ДНК-матрица – это ДНК любого человека. В ней обязательно будет один из аллелей TPOX (в приведенном примере AATG повторяется 11 раз).
2) Прямой и обратный праймеры (на рисунке обозначены синими стрелками; праймеры могут быть разными у разных производителей).
3) Набор реактивов для ПЦР и недорогой амплификатор должны быть дома у каждого начинающего молбиолога, это понятно.
4) После ПЦР, как мы помним, получается очень много ДНК – настолько много, что её даже можно увидеть невооруженным глазом. Для этого продукты ПЦР подвергаются гель-электрофорезу:

Под цифрой 1 у нас «аллельная лестница» – «калибровочная» смесь, которая поставляется производителем вместе с праймерами, это смесь восьми аллелей TPOX, полученных путем ПЦР для данной пары праймеров. Аллели TPOX нумеруются от 6 до 13 (по числу повторов AATG), на картинке слева направо располагаются аллели 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6.

Под цифрой 2 – продукт ПЦР микросателлита TPOX конкретного человека; видно, что у него восьмой аллель.

Теперь он и меня посчитал!

При стандартном геномном исследовании (CODIS) проводят анализ на 13 разных маркеров, результат выглядит примерно так:

Почему по большинству маркёров два аллеля?
Так и должно быть – один аллель от мамы, один от папы. По нашему родимому Тпоксу и от мамы, и от папы достался 8 аллель, так тоже бывает.

AMEL определяет пол человека, данный генетический профиль принадлежит мужчине.

Точность метода
Каждый маркер, применяемый для геномного исследования, имеет примерно 10 аллелей. Следовательно, вероятность наличия у вас определенного аллеля по одному маркёру равняется 1/10. По двум маркёрам вероятность будет равна 1/10 в квадрате, по трем маркёрам – в кубе и т.д. Вероятность того, что все ваши аллели по всем тринадцати маркёрам КОДИСа совпадут с аллелями другого человека, равняется 1/10 в 12 степени, это одна триллиардная. По моему, достаточно точный метод.

Вот, собственно, и все: в базу ФБР занесен ваш генетический отпечаток пальцев. Теперь если в ограбленном банке найдут волос с таким же набором аллелей, вам придется очень долго отмазываться.

Как с помощью ПЦР определяют отцовство

В принципе, это та же самая ДНК-дактилоскопия. Возьмем для примера тот же самый TPOX и посмотрим на результаты того же самого гель-электрофореза:
1) аллельная лестница;
2) 8 аллель предполагаемого отца;
3) 10 аллель ребенка;
4) 9 и 10 аллели матери.

Результаты показывают нам, что ребенок вполне может быть ребенком этой матери (подмены в роддоме не было), но точность такого утверждения не так уж велика – TPOX-10 имеется у 7% жителей РФ. Для однозначного определения нужно исследовать еще парочку маркёров.

С «папой» же ситуация однозначная: он никак не может быть биологическим отцом ребенка. Дальше пошла литература: если, ругая себя за мнительность/ревность, «папа» в тайне от любимой жены и горячо любимого ребенка всё-таки сделал анализ, то это одна история. А если «папа» таким образом успешно отбился от алиментов, то другая.

Тестики

1. Какие из следующих компонентов необходимы для проведения полимеразной цепной реакции
А) обычная ДНК-полимераза из Е. coli
Б) специальная ДНК-полимераза
В) праймеры двух видов: к началу и к концу амплифицируемой последовательности
Г) раствор, содержащий набор дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (А, Т, G, С)
Д) раствор, содержащий набор рибонуклеозидтрифосфатов (A, U, G, С)

2. Для осуществления ПЦР (полимеразной цепной реакции) необходимы:
А) праймеры;
Б) ДНК полимераза, способная выдерживать высокую температуру;
В) АТФ:
Г) матрица ДНК;
Д) температура ниже 0ºС.

3. ПЦР (полимеразная цепная реакция) это один из важных молекулярно-биологических методов. Какое/Какие из следующих утверждений о ПЦР НЕ является/являются правильным(и)?
(1) Для ПЦР необходимы праймеры
(2) Необходима ДНК полимераза, способная выдерживать высокую температуру
(3) Для ПЦР необходима АТФ
(4) Для ПЦР необходима матрица ДНК
A) 1, 2
Б) 2, 3
В) 3
Г) 1, 3
Д) 2, 4

4. Миссис Линг-Линг проводит реакции амплификации ДНК и транскрипции в двух отдельных пробирках. Какое из следующих веществ необходимо добавить в обе реакции?
A) АТФ;
Б) Матрицу ДНК;
В) Праймер РНК;
Г) ДНК-полимеразу;
Д) ДНК-лигазу.

5. Перечислены процессы: 1) плавление, 2) рестрикция, 3) отжиг, 4) элонгация, 5) терминация, 6) инициация. Один цикл ПЦР последовательно включает в себя:
А) 3–1–4–2;
Б) 1–3–4;
В) 1–3–2;
Г) 3–1–2–5.

6. На рисунке показан субстрат для ДНК-полимеразы. Впишите буквенные обозначения (индексы), соответствующие приведенным элементам субстрата.

5) 3´-конец матричной цепи

6) 5´-конец матричной цепи

7. Для амплификации при помощи ПЦР данной последовательности гена
5’-GCGTTGACGGTATCAAAACGTTAT…
…TTTACCTGGTGGGCTGTTCTAATC-3’
необходима следующая пара праймеров:
А) 5’-GCGTTGACGGTATCA-3’ и 5’-TGGGCTGTTCTAATC-3’;
Б) 5’-CGCAACTGCCATAGT-3’ и 5’-TGGGCTGTTCTAATC-3’;
В) 5’-GCGTTGACGGTATCA-3’ и 5’-GATTAGAACAGCCCA-3’;
Г) 5’-TGATACCGTCAACGC-3’ и 5’-GATTAGAACAGCCCA-3’.

8. 5`-ATGACAGATAAGTACCTGTAGACTAGATCGCTATAGCGGATACACA TCGTCATAGCTGACACATAGCGCTATACAGATTCTCGAT-3`
Вы хотите аплифицировать эту последовательность ДНК при помощи ПЦР. Какие праймеры Вы для этого возьмёте:
1)? 5`-ATGACAGATAAGTACC-3`;
2)? 5`-TATACAGATTCTCGAT-3`;
3) 3`-TATACAGATTCTCGAT-5`;
4)? 5`-ATCGAGAATCTGTATA-3`;
5)? 5`-ATATGTCTAAGAGCTA-3`.
A) 1, 2;
Б) 1, 3;
В) 1, 4;
Г) 1, 5.

9. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является методом быстрой амплификации сегментов ДНК. Если к двуцепочечной ДНК добавить необходимые прямой и обратный праймеры (как показано на рисунке ниже), то минимальное число циклов для получения по крайней мере одной копии желаемого фрагмента PQ в виде двухцепочечной ДНК без одноцепочечных концов должно составить:

А) 2;
Б) 3;
В) 4;
Г) 10.

10-12. Др. Чен исследовала функцию гена X у риса с использованием мутанта, в котором Т-ДНК была включена в экзон 2, как это показано на рисунке ниже. Величина Т-ДНК составляла около 5 тысяч пар оснований (kbp). Для генотипирования отдельных растений (A, B, C, D, E) она использовала ПЦР со смесью праймеров I, II, и III и элекеторофорез, как показано на рисунке. На рисунке геля показан результат ПЦР. Молекулярные маркеры размера ДНК показаны на линии М. A-E представляют продукты ПЦР из образцов листьев растений А-E, соответственно. Известно, что использованная полимераза не способна эффективно амплифицировать (увеличивать) фрагменты ДНК размером более 5 kbp.

10. Какая пара праймеров (I+II; I+III; II+III) амплифицирует полосу ДНК на дорожке B?

11. Какое/какие растение(я) (A, B, C, D или E) является/являются гомозиготным(и) мутантом/мутантами?

12. Какое/какие растение(я) (A, B, C, D или E) является/являются потомством F1 гомозиготного мутанта, скрещенного с диким типом?

Еще можно почитать

Инструкция по применению набора реагентов для определения количества тандемных повторов в полиморфных локусах и пола в геномной ДНК человека.

Представление результатов типирования человека аппаратно-программным комплексом 3130 Genetic Analyser

Очень много информации о микросателлитах (англ.).

Генетические вариации микросателлитов у населения северной и центральной Польши (англ.), у населения Японии, Бангладеш, Индонезии (англ.).

Источник

ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции

ВАЖНО!

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Специфичность и применение

ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).

Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.

Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.

Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию

Словарь

Праймер – котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

Литература

ВАЖНО!

Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.

Источник

• ← корм класса холистик для кошек что это
• чем заканчивается книга до встречи с тобой →