что такое клеточная линия в медицине
ЛИНИЯ КЛЕТОК HELA КАК МОДЕЛЬНЫЙ ОБЪЕКТ В БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИКЕ
С самого зарождения медицины шёл поиск модельного объекта, который бы позволил получить условия, аналогичные человеческому организму для разработки и тестирования новых лекарственных препаратов, для проведения экспериментов. Линия клеток HeLa была первой линией человеческих раковых клеток, идеальный модельный объект для проведения исследований человеческих раковых заболеваний и не только. Именно на них была разработана первая вакцина от полиомиелита, всего примерно через год после создания линии. Данный тип клеток считается «вечными», из-за своей способности к бесконечному делению, а именно благодаря тому, что они продуцируют такой фермент как теломераза, позволяющий наращивать теломеры с достаточно высокой скоростью, то результаты с их использованием достаточно достоверно воспроизводят в разных лабораториях. Ещё примечательно то, что на своей поверхности они несут универсальный набор рецепторов, который позволяет использовать их для исследования действия различных веществ. Это могут быть как простые неорганические так белки и нуклеиновые кислоты. Они являются неприхотливыми в культивировании и хорошо переносят заморозку и консервацию. Клетки данной линии, с момента их обнаружения, использовались в исследованиях самых различных заболеваний таких, как рак и СПИД, а также для изучения воздействия радиации и токсичных веществ, составления генетических карт и много чего другого. Благодаря исследованиям на клетках этой линии удалось разработать вакцину против полиомиелита. Их также применяли в исследовании при клонировании, для отработки методов искусственного оплодотворения.
История происхождения и применения линии
HeLa – это клеточная линия, которая была получена в 1951 году после взятия клеток опухоли шейки матки Генриетты Лакс методом биопсии. Эти клетки стали первыми человеческими клетками, способными делиться в лабораторных условиях.
Культура клеток HeLa распространилась по многим лабораториям мира. На ней стали тестировать вакцину от полиомиелита, для этого построили первую фабрику по производству клеточных линий. HeLa впервые была клонирована, отправлена в космос, где ставили многочисленные опыты, заражалась вирусами и облучалась радиоактивными волнами. Благодаря результатам исследований над данной линией, спустя 30 лет ученые выяснили, что вирус папилломы человека (ВПЧ) вызывает рак шейки матки. Клетки HeLa продвинули медицину вперед и спасли жизни многих людей.
В 1955 клетки HeLa стали использоваться учеными по всему миру. Исследовались: метаболизм клетки при раке; старение клеток; причины возникновения СПИДа; особенности многих вирусных заболеваний; воздействие мутагенов на клетки; картирование генов.
Клетки HeLa имели такое большое значения в медицине и биологии, потому что они содержали патологические измененные гены непрерывного митоза раковых клеток человека. Также анализ данных клеток привел к открытию многочисленных хромосомных патологий и частичной геномной гибридизации этих клеток. Благодаря изучению методического деления клетки HeLa генетики пришли к выводу, что весь процесс деления раковых клеток идет неправильно.
В 1953 году на клетках HeLa были проведены первые эксперименты по окраске хромосом гематоксилином. Результатом данных исследований было зарождение генетической медицины.
В 1954 году за счет «бессмертности» HeLa ученые смогли размножить и изучить клоны отдельных клеток, так зародилось клонирование.
В 1965 году появились первые гибриды – химерные клетки, созданные путем слияния HeLa с лимфоцитами мыши.
В 1986 году на модели HeLa был показан механизм заражения клеток вирусом иммунодефицита человека, это способствовало более глубокому пониманию биологии СПИДа.
В 2005 году клетки стали использовать для изучения потенциальных опасностей наноструктур для живых клеток.
Генетические особенности линии
Причиной перечисленных отклонений является вирус папилломы человека, который и был первопричиной причиной раковой трансформации клеток в то время, когда они ещё были частью человеческого организма. ВПЧ способен встраивать свою ДНК в инфицированную клетку и экспрессирует белок-инактиватор небезызвестного белка p 53, играющего важную роль в клетки, выражая антимутагенную и подавляя рост опухолей. Его инактивация приводит к перерождению клетки в раковую. Так же для HeLa характерна гиперактивность белка теломеразы, даруя клеткам бессмертие и способность делится с большой скоростью. В линии клеток HeLa присутствуют около 10 сайтов на хромосомах, в которых был обнаружен геном ВПЧ18.
Применение в современных исследованиях
Клетки HeLa находят широкое применение в различных биомедицинских исследованиях или при разработке новых видов фармацевтических препаратов, в особенности противоопухолевого действия. Было проведено множество исследований на данной линии клеток. Например, исследование при разработке вакцина против полиомиелита, так же ещё одним исследование в котором с использованием МТТ-теста необходимо провести сравнение цитотоксического действия цисплатина в отношении клеток линии HeLa Kyoto и линии HeLa Kyoto, содержащей генетически-кодируемый сенсор пероксида водорода HyPer2 (линия HeLa Kyoto–HyPer2), и с помощью метода окрашивания трипановым синим выявить дозы цисплатина, вызывающие гибель клеток при различных сроках воздействия, то есть проверить чувствительность клеток линии Hela Kyoto, трансфицированных сенсором HyPer2, к действию цисплатина. И результатами данного исследования стало то что, благодаря изучению цитотоксического действия цисплатина данным методом удалось определить концентрацию препарата, вызывающую гибель определенного числа клеток, а также чуть позже выяснилось что концентрация цисплатина, соответствующая IC50, при воздействии в течение 24 ч не приводит к гибели клеток HeLa Kyoto–HyPer2, а вызывает торможение их деления.
Также можно сказать про современное исследование, где исследователи из университетов Цинхуа и Дрексельского изготовили опухолевидный комок раковых клеток с помощью 3D-принтера. Для этого они смешали такие вещества как желатин, альгинат натрия, фибрин и линию клеток Hela, после чего данная смесь подавалась в 3D-принтер и он слой за слоем воспроизвел структуру опухоли. Ещё одним важным экспериментом стоит отметить клонирование. Благодаря успехам ученых из Колорадо, многие ученые использовали клоны клеток линии Hela. Вскоре первые технологии клонирования и выращивания клеток привели науку к значительным успехам, включая выделение стволовых клеток, клонирование целых животных и экстракорпоральное оплодотворение.
На данный момент линия клеток HeLa является одним из мощнейших модельных объектов, и являются даже более актуальными, чем 50 лет назад, в года своего открытия. Они находят широкое применение во многих областях биологических и медицинских наук. Эти клетки являются незаменимым инструментом при исследовании и борьбе с одним из наиболее резистентных заболевания двадцать первого века – раком. И самое важное, что применение клеток HeLa на ежегодной основе позволяет снизить угрозу жизни людей-добровольцев, упростить доклинические испытания и избежать применения лабораторных животных.
Что такое клеточная линия в медицине
Постоянная (непрерывная) клеточная линия — это клетки, способные субкультивироваться вне организма в течение неограниченного количества пассажей. На уровне знаний о поведении культивируемых клеток невозможно определить точку, когда культура становится стабильной, т. е. приобретает способность расти до бесконечности. Только на основе опыта с фибробластоподобными клетками человека показано, что культура должна субкультивироваться, по крайней мере, 70 раз с интервалом примерно в три дня, прежде чем ее можно будет считать постоянной (непрерывной) линией клеток.
Все культуры с неограниченной способностью к размножению («бессмертные культуры») следует называть постоянными (непрерывными) или стабильными линиями. В вирусологической литературе широко распространен термин «перевиваемые линии клеток», под которым имеются в виду линии клеток, способные к бесконечному росту вне организма.
Под трансформацией клеток подразумевают необратимые генетические изменения, характеризующиеся изменением ростовых свойств культивируемых клеток. Трансформация делает клетки бессмертными и менее зависимыми от питательных факторов и геометрических параметров роста. Изменение ростовых свойств связано с изменением транспортировки питательных веществ через клеточную мембрану и является одной из адаптивных особенностей, позволяющих клеткам размножаться в условиях, неблагоприятных для не трансформированных родительских клеток.
Получение постоянных линий намного расширило исследования в области клеточной биологии и вирусологии. На их основе появилась возможность получения мутантных и гибридных линий клеток, что открыло перспективу создания новых субстратов, пригодных для культивирования вирусов. Нормальные клетки удается субкультивировать вне организма в течение ограниченного количества пассажей, после чего их размножение прекращается и они, как правило, погибают. Это обычно происходит примерно после 50 генераций, если клетки получены из тканей взрослого организма.
Лишь иногда они способны продолжать размножаться в культуре неограниченно долго, превращаясь в так называемые трансформированные постоянные клеточные линии. Трансформация клеток в культуре имеет полиэтиологическую природу. Спонтанная трансформация культур клеток нормальных тканей — относительно редкое событие. Частоту таких трансформаций можно увеличить, обработав клетки мутагенами или некоторыми вирусами.
Все постоянные клеточные линии, в отличие от культур нормальных клеток с ограниченным сроком жизни, являются трансформированными, т. е. измененными по ряду признаков, главным из которых является «бессмертие». Способность к неопределенно длительному размножению в культуре, как правило, связана с анеуплоидным кариотипом. Некоторые линии клеток (например, фибробластов хомячка — ВНК-21) хотя и обладают правильным диплоидным числом хромосом, но их кариотип, по-видимому, изменен. Другие критерии трансформации (онкогенность, контактное торможение требования к среде) проявляются у различных линий неодинаково.
Все они получены в результате спонтанной или индуцированной трансформации клеток в организме или в культуре. Многие происходят из опухолей животных, хотя не всегда при эксплантации опухолевых клеток in vitro образуются клеточные линии. Линии клеток, полученные непосредственно из опухолевых тканей (т.е. трансформированных в организме), часто сохраняют специализированные функции, например, способность продуцировать некоторые ферменты в течение более продолжительного периода, чем клетки, трансформированные в культуре различными методами (физическими, химическими, вирусными агентами). Частота получения постоянных линий у различных видов млекопитающих неодинакова.
Клетки мышей подвергались спонтанной трансформации значительно чаще, чем клетки человека или других млекопитающих. Указанные различия, по-видимому, связаны с неодинаковой стабильностью кариотипа разных видов животных.
Трансфекция культуры клеток почки эмбриона человека онкогеном вируса SV-40 увеличивала период размножения in vitro от 15-20 до 70-90 поколений. Из популяции таких клеток удалось выделить две постоянные линии, практически не имеющие признаков трансформации. В результате трансфекции гепатоцитов нормальных крыс ДНК вируса SV-40 получена серия клеточных линий SV-40 гепатоцитов. С помощью рекомбинантного вектора SV-40-аденовируса получены различающиеся по свойствам постоянные линии клеток стромы костного мозга человека, экспрессирующие большой Т-антиген вируса SV-40. Т-штамм вируса ретикулоэндотелиоза кур вызывал трансформацию культур клеток печени, селезенки, костного мозга, а также тимуса куриных эмбрионов и молодых цыплят. Подавляющее большинство трансформированных линий клеток секретировало вирус, вызывающий летальный ретикулоэндотелиоз у 1—2-дневных цыплят.
Предпочтительными сайтами интеграции вирусного генома оказались ломкие участки в геноме млекопитающих, что обусловлено, по-видимому, их структурными и функциональными особенностями. Результатом взаимодействия вирусного и клеточного геномов могут явиться хромосомные аномалии и приобретение клетками способности к неограниченному размножению.
При длительном культивировании клеточные линии могут изменять те или иные свойства, поэтому для поддержания исходных свойств расплодки клеток, их хранят при низкой температуре и периодически берут для размножения и практического использования. Например, в процессе многих циклов выращивания клеток ВНК-21 в однослойной культуре могут значительно изменяться их первоначальные свойства. Нормальный равномерный рост фибробластоподоб-ных клеток может смениться ростом эпителиоподобных клеток, образующих слои и грозди. От свойств сыворотки также зависит скорость роста клеток и чувствительность к разным типам и штаммам вируса ящура.
Большинство таких изменений характерно для трансформированных клеток других линий.
Основные технологические процессы, используемые при производстве биомедицинских клеточных продуктов
Автор: Михаил Васильевич Супотницкий.
(в соавторстве с Елаповым АА, Меркуловым ВА, Борисевичем ИВ, Климовым ВИ, МироновымАН)
Получение специфичных, эффективных и безопасных биомедицинских клеточных продуктов (БМКП) предполагает осуществление следующих типовых операций: а) получение клеточной линии определенного клеточного состава; б) наработка клеток определенной клеточной линии в количествах, необходимых для терапевтического применения в составе БМКП; в) контроль качества и стандартизация полученной клеточной линии. Наиболее предпочтительными для целей клеточной терапии специалисты считают мезенхимальные стромальные клетки (МСК). Получение клеточной линии определенного клеточного состава включает пять последовательно выполняемых этапов: отбор донора, отбор биологического материала, выделение клеток из материала донора, получение стандартизуемой популяции однородных клеток, охарактеризование клеточного состава клеточной линии и ее паспортизация. Процесс наработки клеточной линии в количествах, позволяющих их терапевтическое применение в составе БМКП, включает подбор питательной среды для выращивания МСК, культивирование в специальных биореакторах, контроль параметров культивирования. Контроль качества и стандартизация полученной клеточной линии предполагает разработку общих требований к показателям качества, применимых ко всем клеточным линиям; и частных, которые будут использоваться для оценки терапевтических препаратов, имеющих свой круг показаний (например, для лечения сахарного диабета, костной пластики, восстановление кровоснабжения ишемизированного миокарда). В статье на основе анализа научной литературы и патентов, впервые приведено описание контрольных точек типовых операций и основных технологических приемов, используемых при производстве БМКП и оценке их качества, которые должны быть в поле зрения экспертов контрольного органа; сформулированы требования к содержанию документации, представляемой разработчиком БМКП в регистрационном досье в контрольный орган.
Библиографическое описание: Супотницкий МВ, Елапов АА, Меркулов ВА, Борисевич ИВ, Климов ВИ, Миронов АН. Основные технологические процессы, используемые при производстве биомедицинских клеточных продуктов. Биопрепараты 2015; (2): 36–45.
Developing specific, effective and safe biomedical cell culture products (BCCP) assumes the following standard operating procedures: a) developing cell line with specific cell composition; b) obtaining a sufficient amount of cells of a specific cell line for therapeutic use as a part of BCCP; c) quality control and standardization of the developed cell line. Experts believe mesenchymal stromal cells (MSC) to be the first choice for the purpose of stem cell therapy. The development of a cell line with a specific cellular composition includes five sequential steps: selection of donors, sampling of biological material, cell isolation from donor material, preparation of standardized homogeneous population of cells, characterization of cell line composition of the cell line and its certification. The process of obtaining a sufficient amount of cells of a specific cell line for therapeutic use as a part of BCCP includes the selection of culture medium for cultivation of MSC, in special bioreactors for cultivation and culture control parameters. Quality control and standardization of the developed cell line assumes the elaboration of general requirements for quality parameters, characterizing all cell lines; as well as specific requirements for the assessment of therapeutic preparations in accordance with their proposed indications (for example, for the treatment of diabetes, bone grafting, restoration of blood supply to ischemic myocardium). The article describes typical procedures and identifies possible checkpoints for common technological methods used in BCCP manufacture and their quality assessment. It also outlines the requirements for the content of documents submitted by BCCP developer to an official authority in marketing authorization dossier as well as the expert evaluation procedure.
Bibliographic description: Supotnitskiy MV, Elapov AA, Merkulov VA, Borisevich IV, Klimov VI, Mironov AN. Common technological processes used in manufacture of biomedical cell culture products. Biopreparation (Biopharmaceuticals) 2015; (2): 36–45.
Биомедицинские клеточные продукты (БМКП) – новые перспективные средства профилактики, диагностики и лечения заболеваний (патологических состояний), сохранения беременности и медицинской реабилитации пациента. Их использование позволяет восстанавливать структуру и функцию тканей и органов человека, активировать восстановительные процессы организма человека (регенеративная терапия), создавать ткани и органы биоинженерными методами (тканевая инженерия), адресно доставлять лекарственные препараты в организм человека [1]. Цель данной работы – определить основные технологические процессы, используемые при производстве биомедицинских клеточных продуктов.
Получение специфичных, эффективных и безопасных БМКП предполагает осуществление следующих типовых операций: а) получение клеточной линии определенного клеточного состава; б) наработка клеток определенной клеточной линии в количествах, необходимых для терапевтического применения в составе БМКП; в) контроль качества и стандартизация полученной клеточной линии [2, 3].
Получение клеточной линии определенного клеточного состава
К клеточной линии, способной дифференцироваться в направлении определенного исследователем клеточного типа, относятся линии, сформированные стволовыми клетками (stem cells), т.е. недифференцированными клетками, являющимися клональными предшественниками специализированных клеток, формирующих органы и ткани. В настоящее время обнаружены несколько типов стволовых клеток, которые могут быть использованы для разработки БМКП (рис. 1) [2].
Рис. 1. Типы стволовых клеток, которые могут быть использованы для разработки БМКП^ 1 – клетки кожи; 2 – нейроны; 3 – пигментные клетки; 4 – сердечная мышца; 5 – клетки костной ткани; 6 – гемопоэтические стволовые клетки; 7 – клетки ткани сустава; 8 – трубчатые клетки; 9 – клетки поджелудочной железы; 10 – клетки щитовидной железы; 11 – клетки легкого; 12 – лимфоциты; 13, 14, 15 – различные миелоидные линии; 16 – эритроциты [2].
Эмбриональные стволовые клетки (embryonic stem cells, ESCs) – клетки ранней стадии эмбрионального развития (до формирования бластоцисты). Для них характерно неограниченное размножение и плюрипотентность, т.е. они способны дифференцироваться в любые типы клеток, происходящие из трех зародышевых листков. Их использование в клинической практике ориентировано на лечение патологических состояний, при которых ограничивающим фактором является гистосовместимость тканей. Однако контролировать дифференцировку таких клеток в ткани реципиента сложно, и они могут стать источником формирования тератом. В соответствие с п. 8. ст. 4 Проекта Федерального закона № 717040-6 от 06.02.2015 г. «О биомедицинских клеточных продуктах», использование таких клеток для получения БМКП в России будет запрещено [1].
Региональные стволовые клетки (somatic stem cells, соматические стволовые клетки; adult stem cells, стволовые клетки взрослых) – полипотентные клетки, способные дифференцироваться только в клетки, происходящие из зародышевого листка, например, мезенхимальные стромальные клетки (mesenchymal stem cells, MSCs, МСК), гемопоэтические стволовые клетки (haemopoietic stem cells, HSCs) и др. Такие клетки содержатся во всех тканях и выполняют функцию клеточного резерва, позволяющего замещать поврежденные дифференцированные клетки. В отличие от плюрипотентных стволовых клеток имеют стойкие биомаркеры, отличающие их потомство от клеток других типов. Кроме того, их способность к пролиферации значительно ниже, чем у плюрипотентных стволовых клеток. Они не создают иммунологических проблем и их дифференцировкой управлять значительно проще, чем дифференцировкой эмбриональных стволовых клеток.
Использование региональных стволовых клеток в медицине сопряжено с рядом трудностей: они медленно растут в питательных средах; процесс их дифференцировки длителен; такие клетки трудно получить в количествах, достаточных для терапевтического применения; на направлении дифференцировки в условиях ex vivo сказывается источник их получения; возможно сокращение длины теломер клеток-трансплантатов, что приводит к раннему старению дифференцировавшихся клеток в реципиентных тканях или к их злокачественному перерождению; такие клетки могут нести реципиенту генетические дефекты, имеющиеся у их донора [4, 5].
Первичные или унипотентные клетки (primary cells, unipotent cell) – региональные стволовые клетки на стадии дифференцировки, предшествующей формированию клеток специализированного типа. Например, лимфоидные клетки-предшественники (lymphoid progenitor cells) дифференцируются в лимфоциты, миелоидные клетки-предшественники (myeloid progenitor cells) – в клетки миелоидной ткани, гоноциты (первичные половые клетки, gonocytes) – в сперматозоиды или яйцеклетки.
Наиболее предпочтительными для целей клеточной терапии специалисты считают региональные стволовые клетки и, в частности, одну из их разновидностей – МСК [2–6].
МСК представляют собой фибробластоподобные клетки, изолированные из костного мозга, жировой и других васкуляризированных тканей. По морфологическим особенностям их относят к периоцитам – отросчатым клеткам соединительной ткани, входящим в состав мелких сосудов и капилляров. Предшественниками периоцитов являются адвентициальные клетки – малодифференцированные клетки фибробластического ряда, сопровождающие кровеносные сосуды (рис. 2).
Рис. 2. Схема происхождения МСК. Возможные направления дифференцировки не выходят за пределы их зародышевого листка [7].
Международное общество по клеточной терапии (The International Society for Cellular Therapy) в 2006 г. утвердило три минимальных требования, позволяющих отнести стволовые клетки к МСК [8]:
1) адгезивность к пластику клеточных культур при культивировании в стандартных условиях;
2) экспрессия специфических поверхностных антигенов, определяемых методом проточной цитофлюориметрии у 95 % клеточной популяции: CD105 (мембранный гликопротеин эндоглин), CD73 (экто-5′-нуклеотидаза, 5′-НТ) и CD90 (гликопротеин Thy-1). Одновременно необходимо подтвердить этим же способом отсутствие экспрессии следующих поверхностных маркеров: CD45 (общий маркер для лейкоцитов), CD34 (маркер примитивных гематопоэтических клеток-предшественников и эндотелиальных клеток), CD14 или CD11b (экспрессируются на моноцитах и макрофагах, свидетельствуют о наличии гематопоэтических клеток в культуре МСК), CD79альфа или CD19 (маркеры B-клеток, которые могут в культуре клеток связываться с МСК путем адгезионного взаимодействия) и HLA II (молекулы HLA-DR не экспрессируются на поверхности МСК без стимуляции, например, IFN-гамма). Обнаружение экспрессии HLA-DR подтверждает, что клетки являются стимулированными МСК («stimulated MSC»);
3) наличие у клеток потенциала дифференцировки, т.е. они должны обладать способностью в условиях in vitro дифференцироваться в остеоциты, адипоциты и хондроциты. Дифференцировка в остеоциты демонстрируется окрашиванием ализариновым красным (alizarin red) или окрашиванием по фон Косса (von Kossa staining); дифференцировка в адипоциты – окрашиванием с красителем Oil Red O (Oil Red O staining); дифференцировка в хондроциты доказывается окрашивание альциановым синим (Alcian blue) или иммуногистохимическим окрашиванием на коллаген второго типа (collagen type II). Существуют и другие методы гистохимического окрашивания, подтверждающие потенциал дифференцировки стволовых клеток.
Фирма-производитель БМКП должна подтвердить соответствие БМКП этим требованиям в материалах регистрационного досье.
Получение клеточной линии определенного клеточного состава включает пять последовательно выполняемых этапов [3]. Заявителю необходимо также показать, что все указанные этапы выполнялись в помещениях, обеспечивающих асептические условия по классу А (табл. 1).
Таблица 1. Этапы получения клеточной линии определенного клеточного состава
Действия разработчика БКМП
Действия эксперта по оценке эффективности, безопасности и качества БМКП
Отбор донора в соответствии с законами и подзаконными актами Российской Федерации;
предоставление соответствующих документов в регистрационном досье
Оценка соответствия процедуры отбора донора, изложенной в регистрационном досье, законам и подзаконным актам Российской Федерации
Забор биологического материала
Соблюдение условий проведения этапа (класс чистоты помещения не ниже А, сертифицированные методы отбора биологического материала, использование одноразовых инструментов);
предоставление документов в регистрационном досье, подтверждающих последовательность действий и соответствие типа клеток клеткам ткани, являющейся источником их выделения
Оценка соответствия процедуры отбора биологического материала, изложенной в регистрационном досье, требованиям нормативных документов;
оценка документов регистрационного досье, подтверждающих последовательность действий на этапе и соответствие типа полученных клеток клеткам ткани, являющейся источником их выделения
Выделение стволовых клеток из материала донора
Соблюдение условий проведения этапа культивирования;
предоставление документов в регистрационном досье, подтверждающих последовательность действий, правильности и стандартизации примененных методов (методик), соответствие полученных на этом этапе клеток клеткам ткани, являющейся источником их выделения
Оценка документов регистрационного досье, подтверждающих соответствие методов выделения стволовых клеток, методам работы с данным типом стволовых клеток
Получение стандартизуемой популяции однородных клеток
Проведение серии последовательных пассажей для получения материала, пригодного для внесения в биореакторы (с целью получения БМКП);
подтверждение степени однородности и зрелости популяции полученных на этом этапе клеток, их мезенхимальной природы;
предоставление результатов в регистрационное досье
Анализ приведенных доказательств степени однородности и зрелости популяции клеток, подтверждения их мезенхимальной природы
Охарактеризование клеточного состава клеточной линии и ее паспортизация
Необходимо подтвердить, что заявленная клеточная линия представляет собой линию МСК и может использоваться для терапевтических целей;
предоставление результатов в регистрационное досье;
паспортизация полученной клеточной линии
Анализ приведенных доказательств степени однородности и зрелости популяции клеток, подтверждения их мезенхимальной природы, жизнеспособности, биохимической активности, целостности кариотипа, соответствия иммунофенотипическим маркерам клеточной дифференцировки и заявленному происхождению клеточной линии, потенциала дифференцировки;
оценка результатов паспортизации полученной клеточной линии
Первый этап получения клеточной линии определенного клеточного состава – «Отбор донора». Регулируется законодательными актами и подзаконными актами Российской Федерации. В проекте Федерального закона № 717040-6 от 06.02.2015 г. «О биомедицинских клеточных продуктах» [1] процедуре получения биологического материала для производства биомедицинского клеточного продукта посвящена глава 6. Порядок медицинского обследования донора биологического материала для выявления противопоказаний для получения биологического материала в целях производства биомедицинских клеточных продуктов, включая тестирование на носительство инфекционных агентов, и перечень противопоказаний (абсолютных и относительных) для получения биологического материала в целях производства биомедицинских клеточных продуктов будут утверждены уполномоченным федеральным органом исполнительной власти (см. п. 6 ст. 40 проекта Федерального закона № 717040-6 от 06.02.2015 г.) [1]. Задача эксперта на данном этапе – оценка по представленным документам соответствия использованной разработчиком БМКП процедуры отбора донора законодательным и подзаконным актам Российской Федерации.
Второй этап – «Забор биологического материала» предполагает осуществление в асептических условиях следующих операций:
— получение тканей донора (кожа, подкожно-жировая клетчатка, костный мозг, плацента, пульпа зуба и др.) специальными хирургическими инструментами;
— их измельчение (расслоение) с помощью мягкого механического воздействия (кожа, плацента, пуповина), разделения центрифугированием в градиенте фиколл-урографина (костный мозг) или дифференциальным осаждением (жировая ткань);
— получение из тканей донора смешанной суспезии клеток, обычно путем инкубирования в 0,1% растворе коллагеназы первого типа (кожа, ткань плаценты или пуповины);
— концентрирование дифференциальным осаждением (центрифугирование при 300 g) либо разделением в градиенте фиколл-урографина (для получения МСК костного мозга).
МСК из различных тканей одного вида неэквивалентны даже при том, что они сходны по основным иммунотипическим характеристикам [9]. Например, они могут иметь различия по способности к пролиферации и дифференцировке и по экспрессии некоторых маркеров. Установлено, что при одинаковом иммунофе`нотипе МСК из селезенки фетального происхождения имеют сниженные потенции к адипогенезу, а МСК из печени фетального происхождения – к остеогенезу [10]. МСК кожи дифференцируются только в адипоциты и, несмотря на свою мезенхимальную природу, они не обладают мультипотентностью, являясь, скорее, унипотентными клетками [11]. Поэтому эксперт при анализе материалов регистрационного досье, с привлечением научной литературы, должен сравнить соответствие типа клеток, указанных в спецификации на БМКП, клеткам ткани, являвшейся источником их выделения и медицинскому назначению БМКП.
Третий этап – «Выделение стволовых клеток из материалов донора». В полученной на предыдущем этапе суспензии клеток стволовые клетки составляют сотые доли процента. Морфологическая гетерогенность клеток суспензии вызвана наличием в ней клеток других тканей и различной степенью «зрелости» мезенхимальных клеток. Их относительное количество определяется особенностями ткани, из которой проводилось выделение клеток, и способом, использованным для получения клеточной суспензии.
На этом этапе получить клеточную линию определенного клеточного состава обычно не удается из-за примеси клеток другого происхождения, способных к адгезии к пластику. Так, для клеточной суспензии, полученной из костного мозга, характерно наличие нескольких популяций клеток, способных прикрепляться к поверхности пластика. Для клеток, полученных из пуповины и плаценты, характерно наличие мезинхимальных клеток различной степени «зрелости». В ходе культивирования происходит постепенное увеличение доли мелких, митотически активных фибробластоподобных клеток (рис. 3 и 4).
