что такое калибровочный график в биохимии

Методы измерения в клинической биохимии

Все измерения в клинической биохимии (как собственно и во всех других областях) выполняются прямым либо косвенным методом.

В первом случае проводится прямое измерение заданных аналитов.

При косвенном методе измеряется одна величина и пересчитывается в другую. При этом измеряемая величина должна иметь функциональную зависимость от рассчитываемой.

Для прямых измерений используются специальные датчики (или чипы), которые реагируют только на наличие того вещества, для поиска которых они созданы. Это могут быть ионоселективные датчики, датчики глюкозы, лактата, pH, датчики газов. Прямой метод является весьма точным и дешевым способом измерения. Однако, его недостаток состоит в том, что прибор, созданный для измерения какого-либо одного аналита не сможет измерять концентрацию других веществ, что сужает применение приборов данного типа. Для измерения концентрации, скажем, 30-40 веществ (а обычно столько методик и выполняют в лабораториях), необходимо столько же приборов.

Универсальность измерений обеспечивается устройствами, использующими косвенный метод измерения. К таким относятся программируемые и автоматические фотометры. В этом типе приборов реализован принцип фотометрирования, при котором регистрируют оптическую плотность и ее изменения.

Измерение концентрации белков, микроэлементов, ферментов, гормонов в биологических жидкостях осуществляется с использованием специальных наборов реагентов, при взаимодействии которых с соответствующими аналитами происходит измерение окраски реакционной среды, что регистрируется фотометрически.

Следует иметь в виду, что исследуемый материал должен быть оптически прозрачным посуда, в которой производится фотометрирование (в противном случае фотометрирование будет затруднено или вообще невозможно).

Еще сравнительно недавно в лабораториях для биохимических исследований применялись в основном достаточно простые фотометры (типа ФЭК, КФК и т.п.). В последнее время таких инструментов остается все меньше, но до сих пор и они еще встречаются. Измерения сопровождаются вычислениями (иногда довольно трудоемкими). От лаборанта требуется приготовить исследуемый образец, согласно требованиям того набора реагентов, который он собирается использовать, провести биохимическую реакцию, затем произвести фотометрирование, произвести необходимые расчеты и получить результат.

Следующим шагом в развитии приборного оснащения являются программируемые фотометры (приборы типа Stat Fax). Используя эти инструменты, заранее их запрограммировав на достаточно большое количество методик можно существенно ускорить работу. Однако и эти инструменты не выпадают из цепочки: исследуемая среда → измерительный прибор → результат. От качества пробоподготовки, проведения реакции и чистоты посуды существенно зависит точность результатов.

Автоматические биохимические анализаторы позволяют существенно ускорить и упростить процесс получения конечного результата. В этом инструменте проведение реакции (разведение исследуемого образца и реагента, выдерживание времени реакции) и фотометрирование производится автоматически. Роль лаборанта сводится к правильной пробоподготовке (приготовлению исследуемого материала) и загрузкой на борт прибора исследуемых образцов и реагентов. Однако и здесь есть некоторые подводные камни. Вся работа должна в точности соответствовать заданной методике (алгоритму выполнения приготовления реакционной смеси, регистрации и расчета) и попытки что-либо изменить в методике (обычно это делается с целью экономии либо времени, либо расходных материалов) приводит к негативным последствиям, как в точности измерений, так и работе прибора в целом.

Кроме того, при использовании косвенных методов измерения, следует помнить о том, что в самом принципе косвенного метода заложена определенная погрешность.

Поэтому для каждой методики указывается ее точность и воспроизводимость, что необходимо учитывать. Кроме того, в любом инструменте содержатся узлы (а в автоматах их очень много), которые требуют технического обслуживания (очистка, регулировка, замена изношенных деталей). Если этого не делать, то по мере износа прибора точность измерения будет снижаться, а достоверность измерений может вызывать сомнения. Это возникает вследствие износа дозирующих устройств, загрязнения оптического канала, люфтов подвижных устройств.

Фотометрирование в биохимии служит для определения искомого вещества в исследуемой среде и (или) вычисления его концентрации, либо активности, используя изменение окраски реакционной смеси (либо интенсивности окраски, т.е. ее оптической плотности). Как правило, фотометрирование производится на определенной длине волны, которая подбирается таким образом, чтобы поглощение света для данной реакционной смеси было максимальным.

Рисунок 1. Принципиальная схема фотометрического анализа

Расчет результатов измерений производится в зависимости от типа реакции. В частности здесь будут рассмотрены методы расчета по конечной точке, кинетические, псевдокинетические и их производные. В каждом случае расчеты производятся по коэффициенту (фактору), по одному стандарту, либо по калибровочной зависимости сложного вида (мультистандартная калибровка).

Определение по конечной точке

После смешивания реактива и образца, начинается химическая реакция, которая сопровождается изменением оптической плотности (Abs). По истечении времени инкубации, которое задается в методике, реакция прекращается, и изменение оптической плотности также прекращается. Оптическая плотность становится более-менее постоянной величиной, пропорциональной концентрации искомого вещества. В этот момент и производится измерение оптической плотности.

Рисунок 2.

Остановимся на этом моменте подробнее.

Factor = сtg a
Рисунок 3.

Получив такой график, который называется калибровочным, измеряя оптические плотности последующих образцов (исследуемых), можно высчитать концентрацию искомого вещества.

При использовании калибровки по стандарту, расчет производится по следующей формуле:

При использовании современных инструментов фотометрирования (специализированных фотометров), концентрация высчитывается автоматически. При этом автоматически высчитывается фактор – пропорциональный углу наклона калибровочного графика по отношению к горизонтали (на самом деле высчитывается тангенс угла наклона).

Еще одна разновидность реакции по конечной точке – расчет по фактору.

В этом случае замеряется оптическая плотность бланка и по уже заданному фактору (который пропорционален углу наклона) производится измерение плотностей исследуемых образцов.

Формула для расчета будет следующей:

Еще одна разновидность конечно-точечной реакции – определение по сложной калибровочной кривой. Такая калибровочная зависимость применяется, когда интенсивность изменения окраски не прямо пропорциональна концентрации искомого вещества. В таких случаях используют несколько стандартов (до 9).

Рисунок 4.

Если говорить о современных методах исследований, то такая калибровка применяется чаще всего в методах иммунохимии.

Кроме всего, следует упомянуть о методах бихроматического фотометрирования. Этот метод является частным случаем метода по конечной точке. Вместо оптической плотности измеренной на одной длине волны, в расчете используется разность оптических плотностей, измеренных на двух длинах волн – основной и вспомогательной (часто в терминологии используется термин – дифференциальный). Такой метод определения используется, когда нужно «отфильтроваться» от помех, обусловленных оптическими свойствами емкости, в которой производится фотометрирование (например, цилиндрическая пробирка), мутностью исследуемого образца (а иногда и окраской).

Еще одним частным случаем метода определения по конечной точке является дифференциальный метод (метод с холостой пробой по образцу). При использовании этого метода на одном и том же исследуемом образце приготавливается две пробы – одна с неполной композицией реагентов (когда не происходит специфическое окрашивание образца), вторая с полной композицией реагентов, когда специфическое окрашивание происходит. Разница оптических плотностей этих двух проб пропорциональна концентрации исследуемого вещества.

Кинетические методы измерения

Кинетические методы измерения – это методы, когда изменения оптической плотности регистрируются во времени и измеряется скорость изменения, которая пропорциональна либо концентрации исследуемого вещества, либо активности этого вещества (например, ферментов).

Ниже показан типичный пример кинетического измерения.

Рисунок 5.

Расчет производится либо по фактору, либо по стандарту.

Активность ферментов обычно вычисляется по фактору:

Расчет с калибровкой по стандарту:

В случае калибровки по стандарту, расчет происходит по той же самой формуле, только здесь фактор не является параметром, заданным в методике на реагенты, а вычисляется по формуле:

Псевдокинетические методы измерения (двухточечная кинетика).

Здесь также определяется скорость изменения оптической плотности по времени реакции, только здесь измеряется оптическая плотность в начале интервала измерения (после ЛАГ-фазы) и в конце.

Источник

Методические указания для обучающихся к практическому занятию для аудиторной работы, тема: «Построение калибровочных графиков»

ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развтию»

Кафедра Клиничео-лабораторной диагностики

К ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗАНЯТИЮ для аудиторной работы

Тема: «Построение калибровочных графиков»

Утверждена на кафедральном заседании

(межкафедральной методической конференции)

«_____»__________________ 2010 г.

к. м.н., доцент _______________________

к. м.н., доцент _____________________

Учебная цель: Познакомить курсантов с правилами построения калибровочных графиков, методами расчета контрольных точек и способам проверки построенного графика.

На практических занятиях: специально разработанные задачи для закрепления на практике полученной теоретической базы.

Практические навыки, которыми должен владеть курсант

Вычисление точек для построения калибровочного графика двумя способами

Знание методики проверки калибровочного графика

Знание основных принципов использования калибровочного графика

На цикле общего усовершенствования определить базовый уровень знания предмета, оценить умение курсанта находить наиболее верную тактику использования калибровочного графика в сложных ситуациях, которые могут создаться на рабочем месте.

На цикле ППС подробно разобрать требования к калибровочным материалам и правила их приготовления. Отработать на специальных примерах принципы построения калибровочного графика и способы расчета калибровочных растворов, и способы проверки правильности построения калибровочной кривой. В конце занятия проверить степень усвоения разобранной темы и подробнее остановиться на вызвавших затруднение вопросах.

При подготовке к занятию прочитать всю доступную литературу по данной теме, а в методическом кабинете проработать разработанное на кафедре учебное пособие. Самостоятельно используя стандартные наборы различных производителей рассчитать разными способами точки для построения калибровочной кривой, ответить на все контрольные вопросы которые приводятся в конце данного пособия. Если возникли какие-либо затруднения сформировать логически вопрос и задать его преподавателю на практическом занятии либо в начале, либо по ходу разбора темы.

1. Количественные проблемы биохимии, М. 1983

2. Унификация лабораторных методов исследования. Стандартизация качества унифицированных клинических лабораторных методов исследования, М., 1981.

3. Лабораторное дело, 1977, №4, 253.

4. Камышников по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2т. т.1 – Мн.: Беларусь, 2000. – 495 с.: ил.

В основе всех колориметрических методов положено светопропускание и светопоглащение. Приборы, используемые в фотометрическом анализе позволяют определить оптическую плотность и процент светопропускания. Но в отделение выдается результат исследования не в единицах оптической плотности, а в единицах концентрации. Экстинция исследуемого образца сравнивается с экстинцией образца компонента с точно известной концентрацией. Расчеты ведут по формуле или калибровочному графику.

Калибровочный график – это графическое изображение связи между измеряемой величиной экстинцией и концентрацией вещества.

Методы исследования, в основе которых лежит сравнение с образцом являются методами сравнения и их точность зависит от точности приготовления калибровочных растворов и чистоты веществ.

Характеристика калибровочных материалов

Для получения воспроизводимых, контролируемых, статистически достоверных и сравниваемых результатов существует система измерений, включающая методологию и соответствующие вещества контролируемого состава. Экспертная группа по номенклатуре качественного контроля предлагает разделить калибровочные стандарты на группы:

— первичные – в которой масса стандартного вещества определяется взвешиванием;

— вторичные – содержание компонентов определяется аналитическим методом.

Требования к первичному стандарту

1. Вещество должно быть стабильным.

2. Вещество должно иметь точно установленный состав.

3. Вещество должно иметь высокий эквивалентный вес, чтобы при взвешивании ошибка была минимальной.

4. Вещество не должно изменяться при очистке, сушке и т. д.

Этим требованиям в настоящее время соответствуют не все вещества, в основном неорганические.

В качестве калибровочных материалов могут использоваться вещества различной природы и степени чистоты, в зависимости от поставленных задач.

Правила при приготовлении калибровочных растворов

1. Используемое вещество должно быть максимально возможной чистоты с максимум содержания основного вещества – более 99,9 %. Чем чище вещество, тем оно стабильнее.

Например: есть вещества степени чистоты хч, чда, ч. Берем хч.

2. Навеска отвешивается с большой точностью на аналитических весах (в ряде случаев допустимо использование торсионных весов), но всегда в таре, с которой вещество можно смыть растворителем.

3. Навеска должна быть довольно большой, чтобы повысить точность взвешивания. Если по методике требуется слабый раствор, то готовят более концентрированный, а затем его разбавляют. Чем больше навеска – тем выше точность.

4. Иногда в методике есть специальные указания (например: высушить до постоянного веса и т. д.). Сушить можно прокаливанием, в термостате, в эксикаторе, выветриванием. Нужно посмотреть по химическому справочнику термоустойчивость вещества. Обязательно взвешивание до и после высушивания.

Нельзя готовить калибровочные растворы из гигроскопичных веществ.

Альбуминосодержащие калибровочные растворы следует применять в случаях, когда это указано в методике или если необходимо проверить влияние белка на надежность метода.

Диапазон стандартных растворов

То есть концентрации веществ должны быть адоптированы к пределам нормы и чувствительности метода, и график обычно включает не менее 4-5 точек.

-Х—— средняя величина

При проверке надежности метода, кроме того, следует определить:

-прямолинейность выше максимальной точки калибровочной кривой;

-прямолинейность между нулевой точкой и минимальной на калибровочной кривой. Для этого готовят еще по 3 точки (эквидистантные концентрации).

Для каждой выбранной точки готовят калибровочный раствор, который обрабатывают по методике в параллельных пробах (не менее 2-3), на график наносится среднее значение.

Общие требования

1. Разведение стандартного раствора готовят в арифметической, а не геометрической прогрессии, выдерживая 1 шаг: 0,1 мг, 0,2 мг, 0,3 мг и т. д.

2. При измерении оптических плоскостей следует учитывать оптическую плотность реактивов, иначе точка не пройдет через 0. Для этого колориметрируют против контроля, содержащего все реактивы.

Оптическую плотность, полученную для калибровочных растворов, наносим на систему координат. Лучше всего пользоваться миллиметровой бумагой достаточно большого размера. По оси ординат откладывается плотность, по оси абсцисс – концентрация. Масштаб выбирается произвольно: для концентраций – чтобы можно было считать с точностью, соответствующей практическим требованиям с учетом пределов нормы и чувствительности метода; для экстинции – учитывая цену деления прибора. Оптимально, когда наклон кривой к оси абсцисс проходит под углом 450. При малом масштабе угол будет больше и кривая более крутая, при большем масштабе – кривая проходит более полого.

Если в пределах выбранных концентраций растворы соответствуют закону Ламберта-Бера, то график проходит через 0 точку и имеет вид прямой.

Всегда ли кривая в выбранном диапазоне концентраций проходит через точку 0? Нет, не всегда, даже если кривая правильная. Это может быть: 1. если реакция при больших и малых концентрациях протекает не строго стериохимически; 2. если исследование ведется не в монохромном свете. Надо перейти на другой прибор.

НО ВСЕГДА НАДО РАБОТАТЬ НА ЛИНЕЙНОМ УЧАСТКЕ КРИВОЙ.

Иногда это невозможно. Например, при определении белка по Лоури, где кривая очень быстро выходит на плато. В этом случае строят графическую калибровочную кривую. Кроме основных калибровочных растворов, проходящих по прямолинейному участку, берут не менее 10 стандартных растворов, проходящих по прямолинейному участку, берут не менее 10 стандартных растворов, соответствующих пологому участку. Т. е. на пологом участке будет много точек.

Приготовление калибровочных растворов

Из основного калибровочного вещества готовят ряд стандартных проб. Они могут быть приготовлены 2-мя способами, в зависимости от биохимии метода.

1 способ: Необходимая концентрация стандартного раствора обеспечивается за счет различных объемов одного и того же маточного (основного) стандартного раствора.

Источник

Методы математической обработки данных в иммуноферментном анализе

Авторы: Свежова Н.В., Шаркова В.Е., Громов Д.Б., Головаченко В.А., Полынцев Д.Г.

ЗАО «Алкор Био», Санкт-Петербург

Представляемая вашему вниманию статья посвящена вопросам математической обработки данных иммуноферментного анализа (ИФА). Статья состоит из двух частей. Первая часть содержит краткое сравнительное описание основных способов представления экспериментальных данных и построения калибровочной кривой (КК), а также практические рекомендации по выбору математических методов расчета концентраций. Предлагаемые во второй части статьи рекомендации базируются на сравнительном исследовании фотометрического оборудования и программного обеспечения (ПО), наиболее широко используемого в российских клинических лабораториях при проведении ИФА-диагностики. В эксперименте, имитирующем конкурентный анализ, проиллюстрирована зависимость получаемого клинического результата от выбора того или иного способа построения калибровочного графика на основе оптических плотностей калибровочных проб. Представленные результаты исследования показывают, что неправильно выбранный метод обработки данных может приводить как к ложной выбраковке всего проведенного анализа на основании ошибочного расчета концентрации аналита в контрольной сыворотке, так и к ложной диагностике на основании ошибочного расчета концентрации аналита в пробе пациента вблизи точки принятия медицинского решения.

Методы математической обработки данных в иммуноферментном анализе. I.Теоретические основы

Иммуноферментный анализ достаточно прост в исполнении. Тем не менее, в его основе лежат сложные биологические и физико-химические процессы, влияющие на характер получаемых данных и накладывающие определенные ограничения на применимость методов математической обработки результатов.

ИФА реализуется в двух основных модификациях: конкурентный метод и сэндвич-метод. Определение концентрации аналита в лунках планшета проводится спектрофотометрическим методом.

Сэндвич-ИФАиспользуется для определения крупных антигенов, содержащих, по крайней мере, две антигенных детерминанаты (эпитопа). При отсутствии лимитирующих факторов в сэндвич-анализе в рабочем диапазоне метода должна существовать прямая линейная зависимость между величиной сигнала и концентрацией аналита в пробе. Однако, из-за ограниченных количеств антител, сорбированных на твердой фазе, антител, конъюгированных с ферментом, субстрата ферментативной реакции, а также из-за ограниченного рабочего диапазона спектрофотометра реальные кривые сэндвич-анализов могут иметь в разной степени искаженный вид (Рис 1А). При помощи конкурентного ИФА определяют антигены небольшой молекулярной массы с единственным эпитопом. В таком анализе количество метки (конъюгированный с ферментом аналит), связавшейся с антителами на твёрдой фазе и, следовательно, величина сигнала имеет обратную зависимость от концентрации свободного аналита в пробе (Рис. 1Б). Зависимость величины регистрируемого сигнала от концентрации аналита при проведении ИФА практически всегда имеет в той или иной степени нелинейный характер.Причины этого кроются в природе анализа.

ИФА имеет целью определение концентрации искомого аналита в пробах пациентов. Для этого на основании оптических плотностей калибровочных проб и присвоенных им концентраций должна быть построена калибровочная кривая (КК).

Краткий обзор методов построения калибровочной кривой

Процесс построения КК представляет собой задачу аппроксимации зависимости оптической плотности от концентрации аналита в пробе. Термин аппроксимация означает приближение одной зависимости к другой по тому или иному правилу. Предположим, что нам известна зависимость регистрируемого сигнала от концентрации аналита в отсутствие всех неконтролируемых факторов и ошибок – идеальная теоретическая КК. В реальном эксперименте КК всегда отличается от «истинной» вследствие прямых ошибок и влияния меняющихся факторов окружения на оптические плотности калибровочных проб и проб пациентов. Поэтому, говоря о точности построения КК, мы имеем в виду, что, чем точнее построена КК, тем ближе она к неизвестной нам «истинной» природной зависимости. Нахождение приближенных значений функции в промежутках между точками с известными ее значениями называют интерполяцией. С интерполяцией мы сталкиваемся тогда, когда строим КК таким образом, чтобы все калибровочные точки лежали на ней. Частным случаем интерполяции является экстраполяция. С экстраполяцией мы имеем дело в случае, когда нужно определить концентрацию аналита в пробе, оптическая плотность продукта ферментативной реакции в которой выше, чем в калибровочной пробе (КП) с максимальной ОП или ниже, чем в КП с минимальной ОП.

При экстраполяции значения концентрации аналита, полученные по КК, построенным разными методами, могут различаться очень существенно. Экстраполяции выше значения последней калибровочной пробы можно избежать, разводя анализируемую сыворотку таким образом, чтобы ее значение попадало в динамический диапазон анализа. Однако этим способом можно пользоваться только при условии, что в инструкции к набору разрешается разводить сыворотки, т.е. выполняется линейность определяемых при серийном разведении концентраций аналита. Экстраполяция ниже первой калибровочной точки должна считаться ошибкой, даже если программное обеспечение позволяет ее осуществлять, и исключаться из анализа. На практике встречаются случаи, когда программа выдает отрицательные значения концентрации аналита, что противоречит природе вещей и здравому смыслу.

Методы описания зависимости между набором концентраций КП и соответствующих им значений оптических плотностей можно разделить на эмпирические, в которых не делается никаких предварительных предположений о природе искомой зависимости, т.е. о виде калибровочной кривой, и методы, основанные на теоретических предположениях о том, к какому семейству должна принадлежать функция, описывающая КК (7). Для построения КК используют два основных подхода – «ручной», с использованием графических построений, либо методы с применением компьютерных вычислений.

Рассмотрим «ручной» подход к построению КК. В эпоху до широкого распространения компьютерной техники КК, как правило, строили вручную, с помощью миллиметровой бумаги, карандаша и линейки (либо гибкого лекала). Затем по КК графически определяли концентрации аналита в сыворотках. Хотя в рутинной лабораторной практике ручное построение КК в настоящее время практически не применяется, мы рассмотрим здесь его особенности, важные для понимания работы ПО.

Если бы в ИФА существовала линейная зависимость величины сигнала от концентрации во всем диапазоне измерения, то это позволило бы избавиться от многих проблем, в том числе и от субъективности при построении КК «ручным» способом. Для визуального расширения линейной области графика и последующего упрощения процедуры «рисования» графика применяют различные преобразования осей. Подобные преобразования называютсялинеаризующими (2).Форму кривой можно модифицировать, меняя масштаб концентраций антигена, откладываемых по оси абсцисс. Масштаб может быть линейным (Рис. 2А) или логарифмическим (Рис. 2Б). Линейный масштаб используется обычно при определении концентрации измеряемого вещества в узком диапазоне. В широком диапазоне, при изменении концентрации антигена в калибровочных пробах более чем на один порядок, лучше использовать логарифмическую шкалу. В случае сэндвич-анализа логарифмического преобразования может быть достаточно для линеаризации КК.

По оси ординат также могут откладываться разные величины: непосредственно регистрируемый сигнал (оптическая плотность раствора после остановки ферментативной реакции), его логарифм, отношение концентрации свободного аналита к концентрации связанного в арифметической или логарифмической формах или результаты специальных сложных преобразований, о которых будет рассказано далее. Примером такого специального линеаризующего преобразования служит предложенное Родбардом преобразование logit(9).

Построение графиков для конкурентных анализов и сравнение различных анализов упрощается, если представить данные следующим образом: из оригинальных значений сигнала предварительно вычесть среднюю величину фонового сигнала (неспецифического связывания) и представить полученные значения в виде десятичной дроби от среднего значения сигнала в калибровочной пробе «0». Если точная величина фонового сигнала неизвестна, ее принимают равной нулю. Обработанные таким образом оригинальные данные обозначают B/B₀, либо r. Для переменной rможно в дальнейшем применить преобразование logit:

Когда по оси Yнаносится logit(r); а по оси Х – натуральный логарифм концентрации, построенный таким образом график называют преобразованием logit/log(Рис. 2В). При этом преобразовании калибровочный график часто, хотя и не всегда, преобразуется в практически прямую линию. На таком графике возможные погрешности отдельных калибровочных проб обнаруживаются при визуальной оценке качества КК значительно легче (4).

Из-за существенных затрат времени для ручного построения КК ныне почти повсеместно применяются компьютерные программы. Существенным недостатком ручного построения является субъективность интерполяции. Достоинство ручного построения КК состоит в том, что, в отличие от компьютерного построения, оно не имеет погрешности, вызванной ограничениями математической модели, либо недостаточной адекватностью метода вычисления.

Процедуры, применяемые при построении калибровочных графиков вручную, разобраны столь подробно потому, что ПО, применяемое для обработки результатов ИФА, при построении КК позволяет выполнять те же операции. Если при построении графика вручную, линеаризация данных необходима в первую очередь для более точной интерполяции, то при компьютеризованном вычислении целью линеаризации становится, преимущественно, лучшая визуализация КК для последующей оценки ее пригодности при выполнении рутинного внутрилабораторного контроля качества клинических анализов.

Методы оценки полученных зависимостей сигнала от концентрации аналита можно разделить на эмпирические, в которых не делается никаких предварительных предположений о природе искомой зависимости, и теоретические методы, основанные на теоретических предположениях о том, к какому семейству должна принадлежать функция, описывающая калибровочную кривую (7). С этой точки зрения ручное построение КК правильнее отнести к категории эмпирических методов.

Как уже указывалось, эмпирический метод построения КК, как правило, не предполагает существования некой единой функции, описывающей зависимость сигнал-концентрация, единственным требованием является соединение точек непрерывной гладкой линией. Провести линию можно строго через все калибровочные точки или между ними, сглаживая в той или иной степени естественный разброс данных в реальном анализе. Такой подход зачастую выражается в том, что разные участки КК описываются разными функциями. Так, при простой линейной интерполяции от точки к точке, средние значения сигнала для соседних калибровочных проб соединяются отрезками прямой с разными углами наклона; а сплайн представляет собой функцию, составленную из «кусков» многочленов одного порядка, но с разными коэффициентами, «сшитых» в узлах по производным нескольких порядков.

Примерами эмпирического подхода, реализуемыми в ПО, могут служить интерполяцииполиномами (=многочленами) исплайнами.

При интерполяции полиномами (полиномиальная регрессия) происходит подбор и степени многочлена, и коэффициентов при степенных членах эмпирического уравнения регрессии. При задании вручную порядка многочлена (квадратичный или кубический полином) программа осуществляет только подбор коэффициентов. Наиболее распространенным способом выбора наиболее приемлемого уравнения является метод наименьших квадратов. Линейная регрессия первого порядка (аппроксимация прямой линией) является частным случаем такой интерполяции. Ее можно применить, если экспериментальные данные образуют прямую зависимость или их удалось линеаризовать, например, с помощью logit-logпреобразования (4).

Интерполяциясплайнами является частным случаем интерполяции полиномами. Например, кубическая сплайн-функция – это группа сопряженных кубических многочленов, в местах сопряжения которых, первая и вторая производные непрерывны. Для обработки данных ИФА применяются интерполяционные и сглаживающие сплайны (1,3). Интерполяционные сплайны представляют собой гладкую кривую, проходящую через все заданные точки. Использование интерполяционных сплайнов при обработке результатов целесообразно только в случае высокой точности проведения эксперимента. Однако разброс экспериментальных значений обычно получается достаточно большим. В этих условиях интерполяционные сплайны воспроизводят все причудливые осцилляции, обусловленные случайными погрешностями. В результате искажается вид изучаемой зависимости и затрудняется интерпретация результатов эксперимента. Более целесообразным представляется подход, основанный на процедуре сглаживания, призванный уменьшить элемент случайности в результатах измерений. Для этой цели используются сглаживающие сплайны.

Следует избегать применения сплайн-интерполяции в тех случаях, когда характер изменения сигнала в конкретном анализе имеет тенденцию к нерегулярности или немонотонности. На рисунке 3 отчетливо видны колебания, возникающие в тех местах КК, где нарушена монотонность в расположении точек. Повторимся, что причиной осцилляций калибровочного графика является ограничение, присущее всем эмпирическим методам: слишком большое значение придается «точности попадания» значения сигнала на кривую. Тогда случайное отклонение в положении одной калибровочной пробы приводит к систематической погрешности в определении концентрации аналита в пробах пациентов в области этого калибратора.

Все теоретические методы построения КК основаны на том, что природа зависимости сигнала от концентрации аналита считается известной и может быть выражена в математической форме. За счет этого можно частично скорректировать ошибки в исходных данных конкретного анализа, поскольку математическое представление кривой резко ограничивает число возможных конфигураций, которые эта кривая может принимать (7). Недостатком метода является то, что математические модели основаны на упрощенных молекулярно-кинетических схемах иммуноанализа.Тем не менее, в большинстве случаев эти методы представляют собой наилучший алгоритм построения калибровочных графиков.

Наиболее корректными считаются в настоящее время такие теоретические методы построения калибровочного графика, как теоретическая 4-параметрическая логарифмическая логистическая модель (4PL) и преобразование logit-log, являющееся частным случаем 4PL(6). Четыре параметра, оценивающиеся в модели 4PLпри построении КК в конкурентном анализе, – это средний уровень сигнала для бесконечной дозы (фоновый сигнал); средний уровень сигнала для «0» концентрации аналита; отрезок, отсекаемый прямой на оси Yи угловой коэффициент прямой (см Приложение 1,2, Рис. 5). Развитием модели 4PLстала 5-параметрическая логистическая модель (5PL), где добавляется еще пятый параметр, характеризующий степень асимметрии кривой. В Приложениях 1 и 2 модели 4PLи 5PLрассмотрены более подробно, показана их связь с преобразованием logit-log.

Взаимосвязь математических методов обработки данных ИФА представлена в виде блок-схемы на рисунке 4.

Подбор подходящего метода построения КК требует определенного навыка и поэтому находится, как правило, в компетенции разработчиков ИФА-наборов. Оптимальный для данной ИФА-системы метод математического анализа данных должен быть описан в инструкции к набору. В тех случаях, когда инструкция такой информации не содержит, пользователь вынужден самостоятельно выбрать метод расчета концентраций. Необходимо понимать, что используемые при проведении ИФА ридеры предназначены зачастую для измерения ОП в очень разных исследованиях (биохимия, молекулярная биология), следовательно, не все алгоритмы расчетов, как эмпирические, так и теоретические, в имеющемся ПО пригодны для обсчета данных именно ИФА. Чем больше возможности ПО, тем лучше пользователь должен разбираться в том, какая программа подходит к его типу экспериментов. Подбирая программу из списка представленных следует ограничиться только теми, которые перечислены в данной статье, по возможности, отдавая предпочтение теоретическим методам – производным модели 4 PL.

Однако при подборе следует учитывать, что компьютерные методы обработки данных ИФА, и эмпирические и теоретические, могут производить неадекватные построения. Причиной этого может быть, кроме прочего, некорректная реализация использованных в программе алгоритмов, поэтому полученные тем или иным способом калибровочные графики перед началом рутинного использования выбранного метода обсчета необходимо проверять на адекватность. Процедура проверки представляет собой обратный расчет значений калибраторов по их сигналам с использованием уравнения аппроксимирующей КК и сравнение с предварительно заданными значениями этих калибраторов (См. Приложение 3). Чем ближе вычисленные значения КП к заданным производителем концентрациям, тем точнее и адекватнее метод построения КК. Проверка возможна только в тех случаях, если ПО анализатора может проводить эту процедуру самостоятельно или позволяет вводить ОП калибраторов вручную. Этот способ проверки адекватности алгоритма расчета данных ИФА бессмысленно применять в случае использования для построения КК кусочно-линейной аппроксимации и интерполяционных сплайнов, так как непременным условием построения КК этими методами служит ее прохождение через все точки; следовательно рассчитанные концентрации калибраторов всегда будут равны заданным производителем.

Далее в статье будет показано, что методы математической обработки данных играют в иммуноанализе не менее важную роль, чем способ подготовки образцов или точность пипетирования, и могут вносить ничуть не меньший вклад в получение ложных результатов, если будут подобраны неверно.

Рекомендации по выбору метода расчета КК

В процессе выбора и оценки пригодности метода расчета руководствуйтесь алгоритмом, представленным на рисунке 4. Вне зависимости от того, какая программа и по каким причинам выбрана, она должна пройти проверку на корректность реализации алгоритма расчета (см. Приложение 3).

Если калибровочный график имеет линейную форму непосредственно при нанесении оригинальных значений, или графику можно придать линейную форму с помощью математического преобразования переменных, допускается применять линейный метод построения (линейные, полулогарифмические, логарифмические или logit-logоси в сочетании с линейной регрессией или кусочно-линейной интерполяцией). В противном случае, необходимо нелинейное построение (4, 7,12).

Эмпирические методы построения КК представлены в любом ПО достаточно широким списком. Однако они могут адекватно использоваться только в условиях высокой точности и воспроизводимости измерений сигнала, и при их тщательном контроле (3).

Предпочтительно остановить свой выбор на теоретической модели. Однако, как правило, выбор метода построения КК существенно ограничен возможностями доступного ПО – присутствует либо logit-logмодель, либо 4PL. Как показано в Приложениях 1 и 2, построение logit-log, является упрощением модели 4PL, и его, в принципе, может быть достаточно для расчета концентрации аналита в конкурентных анализах с удовлетворительной точностью. Однако следует отдавать себе отчет в том, что, если важна высокая точность определения аналита, 4PLдает более точные результаты, чем logit-log(8). Если есть возможность выбора между моделями 4PLи 5PL, рекомендуется предпочесть последний вариант.

Разные участки калибровочной кривой характеризуются разной степенью непрецизионности, поэтому наилучшая аппроксимация зачастую получается при учете статистического веса каждой отдельной точки (4,7). Если ПО позволяет, желательно применять взвешенный подбор. При построении графика по методу взвешенных наименьших квадратов максимальная значимость придается наиболее точно измеренным значениям сигнала. Значениям сигнала приписываются веса, которые обратно пропорциональны дисперсии между репликатами. Следовательно, точкам с наибольшей точностью, т.е. с наименьшей дисперсией приписывается наибольший вес. Как правило, в иммуноанализе величина дисперсии при различных концентрациях аналита не является постоянной. Для вычисления весов необходимо знать характер изменения погрешности, т.е. зависимость «сигнал-ошибка», во всем интервале КК. Однако, в редких случаях, когда дисперсия примерно постоянна в интервале измеряемых концентраций, взвешенный подбор применять не обязательно, так как в такой ситуации его применение практически не изменит форму кривой (8).

Зависимость дисперсии от концентрации аналита может описываться линейным или квадратным уравнением. Aдекватная математическая форма выражения выбирается путем построения графика зависимости наблюдаемой дисперсии от концентрации аналита и последующей проверки этой зависимости на соответствие предполагаемой модели. Для проведения таких статистических расчетов используется соответствующее ПО, в котором должен быть реализован метод оценки изменения погрешности.

При использовании метода взвешенного подбора, который учитывает изменения величины погрешности вдоль всего интервала концентраций, так же следует удостовериться, что выбранная математическая модель реализована корректно (см. Приложение 3).

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

Логарифмические логистические модели 4 PLи 5 PL

Обозначим истинное среднее значение сигнала как Y_T, а концентрацию – как Х. Математическое выражение для модели 4PLимеет вид:

Значения параметров А, В, С и Dтребуется установить. Для тех разновидностей анализа, в которых среднее значение сигнала убывает с увеличением концентрации, D>0. Для таких анализов при Х®¥, Z®¥. Следовательно, Y_T®A. Аналогичным образом, при Х®0, Z®0, следовательно, Y_T®B. Таким образом, значения А и В представляют собой асимптоты, которые показаны на рисунке 5. На этом рисунке приведен модельный график для конкурентного анализа. Через его характеристики становится возможным интерпретировать параметры Aи В. Параметр А представляет собой средний уровень сигнала для «бесконечной» дозы, который часто обозначается как «фоновый сигнал». Параметр В – это средний уровень сигнала для нулевой концентрации. С – отрезок, отсекаемый прямой на оси Yи D– угловой коэффициент прямой.

Логарифмическая логистическая модель с четырьмя параметрами (4PL). Во всех видах анализа для построения графика методом 4PLвыполняется оценка четырех параметров (А, В, С и D). В алгоритме построения, кроме интенсивности сигнала при нулевой концентрации и «фонового сигнала», учитываются также значения сигнала для всех остальных калибровочных проб.

4PLи подобные нелинейные модели (5,10,11) применяются давно. Обычно они очень хорошо работают для самых разнообразных иммуноанализов, хотя проблемы полностью все еще не исключены. Приведем пример. Один из авторов (7) на собственном опыте наблюдал, как при использовании программного продукта, специально разработанного для построения графиков методом 4PL, систематически отмечалось несоответствие между данными и графиком. На первый взгляд, это говорило о неадекватности выбранной модели. Впоследствии удалось обнаружить, что неэффективным, а следовательно, непригодным, был один из использованных в программе алгоритмов. Построение графиков по нелинейной модели требует мощных вычислительных алгоритмов, которые по своей сути являются итеративными (т.е. повторно применяемыми). Если исходный алгоритм неэффективен, то после того, как он будет последовательно применен некоторое заданное число раз (как это делается в обычной практике), можно не достичь схождения и поэтому полученные значения параметров приведут к несоответствию модели исходным данным. В большинстве итеративных алгоритмов для начала итеративного процесса требуется задать некоторые значения, которые не должны сильно отличаться от оптимальных для данного параметра. В противном случае, поиск численных решений может привести к ложному результату. Этот пример наглядно иллюстрирует высказанное в начале статьи положение о том, что даже правильно подобранные теоретические модели, реализованные в ПО, могут давать КК неадекватные полученным данным. Поэтому, соответствие КК исходным данным следует проверять даже в том случае, когда она построена компьютером с применением теоретической модели. В приведенном примере одним из путей решения проблемы может быть использование другой программы построения графиков, при условии, что она основана на той же математической модели (7).

Логарифмическая логистическая модель с пятью параметрами (5PL) представляет собой развитие модели 4PL. Вводится дополнительный параметр E, за счет которого становится возможна некоторая асимметрия калибровочного графика. Однако, как в любых моделях, чем больше параметров участвует в построении, тем больше данных требуется для того, чтобы конечные построения оставались одинаково достоверными.

В некоторых практических приложениях модели 5PLлучше всего использовать накопленные данные по большому количеству калибровочных проб, чтобы получить достоверную оценку величины Е, а затем считать эту величину постоянной, и не определять ее при каждом анализе, т.е. свести 5PLк 4PL.

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Преобразование logit—log

Математическое выражение для зависимости 4PLможно привести к виду:

В этом выражении rпредставлено как доля сигнала, значение которой находится в пределе от 0 до 1. Это уравнение возможно преобразовать:

Функция в левой части уравнения, очевидно, представляет собой logit(r), таким образом, уравнение приобретает окончательный вид:

Это и есть так называемая модель logit—log. Очевидно, что она является частным случаем модели 4 PL. Различие заключается в способе построения кривой. В модели 4PLпараметры Aи Bопределяются по установленному алгоритму, а в модели logit-logих значения считаются известными. В случае конкурентного анализа параметр А считается равным фоновому сигналу, а параметр В – среднему значению сигнала для калибровочной пробы с нулевой концентрацией. При этом модель сводится к линейной функции с переменными параметрами С и D(6).

Таким образом, для конкурентных анализов 4PLи logit-logметоды построения КК эквивалентны при условии, что расчетные значения параметров А и В в модели 4PLбудут совпадать с полученными экспериментальным путем значениями фонового сигнала и сигнала в калибровочной пробе с нулевой концентрацией, соответственно. Аналогичным образом можно добиться эквивалентности этих моделей и в сэндвич-анализах, но в этом случае через А обозначается величина фонового сигнала, т.е. сигнала в калибровочной пробе с нулевой концентрацией, а через B– значение верхнего асимптотического предела, которое весьма трудно определить экспериментальным путем.

ПРИЛОЖЕНИЕ 3

Проверка выбранной для построения КК модели на корректность реализации алгоритма расчетов

Большинство специализированных программ позволяют выполнить такую проверку. Рассматривая калибровочные пробы как неизвестные образцы, они производят обратное вычисление концентрации аналита в каждой калибровочной пробе на основании значения сигнала и соответствующих параметров графика. Следует помнить, что этот способ проверки адекватности алгоритма расчета данных ИФА бессмысленно применять в случае использования для построения КК кусочно-линейной аппроксимации и интерполяционных сплайнов, так как непременным условием построения КК этими методами служит ее прохождение через все точки; следовательно рассчитанные концентрации калибраторов всегда будут равны заданным производителем.

Если использовать пять калибровочных проб, измеренных по три раза каждая, то полученные в результате интерполяции значения концентраций будут сгруппированы в пять «кластеров» по три значения. Для каждого кластера можно вычислить среднее значение концентрации. Сравнивая полученные таким образом средние значения концентрации калибровочных проб с их номиналами, можно оценить адекватность выбранной модели исходным данным (7,12). Чем ближе вычисленные по КК значения концентрации калибровочных проб к номиналам (истинным значениям) и чем меньше вариабельность для каждой точки (выражается ошибкой среднего, коэффициентом вариации (КВ) или дисперсией), тем точнее модель описывает полученные данные. Накопив и проанализировав достаточное количество таких данных, можно получить информацию об адекватности построения и достоверно оценить величину систематической погрешности, вносимой в процессе построения графика.

Рекомендации

Источник