что такое инактивированная дрожжевая культура

Пищевые неактивные дрожжи: польза и вред, как принимать

Неактивные пищевые дрожжи: состав, из чего делают

Как только не называют этот продукт: и белок для вегетарианцев, и белковый пармезан, и веганский протеин, и нут, и пикантные дрожжи. Но за всеми этими названиями скрывается полезный БАД – неактивные (дезактивированные) пищевые дрожжи – продукт во многих смыслах уникальный и, не имеющий ничего общего с привычными нам пекарскими дрожжами.

В магазинах вы можете встретить порошок или хлопья пищевых дрожжей, которые и имеют интересный вкус, похожий на сыр Пармезан. Отсюда, собственно, одно из названий этих дрожжей.

Почему же они так полезны? Для ответа на этот вопрос нужно обратить внимание на состав пищевых неактивных дрожжей, и там мы можем обнаружить:

Также следует отметить, что существует два вида неактивных пищевых дрожжей, состав витаминов в которых может отличаться:

Пищевые неактивные дрожжи: польза и вред

Пищевые дрожжи – это полезно? Да, безусловно! И прямое тому доказательство – их богатый состав. Чтобы вы понимали, по количеству белка неактивные дрожжи ничуть не уступают яйцам или молочным продуктам. Именно поэтому люди, не употребляющие белки животного происхождения, а также имеющие аллергию на лактозу, могут использовать неактивные пищевые дрожжи для восполнения белка в своем рационе.

Однако, среди полезных свойств пищевых дрожжей также необходимо выделить:

Во многих европейских странах неактивные пивные дрожжи используют в качестве антивирусного и антибактериального средства, наравне с гинкго билоба.

А что по побочным эффектам? Здесь следует выделить такие моменты:

Не стоит вводить в рацион добавку и людям с дрожжевой чувствительностью.

Пищевые дрожжи: как принимать

В первую очередь пищевые неактивные дрожжи можно добавлять в еду как альтернативу сыру пармезан: посыпьте салат вместо соли или добавьте к овощам, готовьте пиццы, пасты, в общем, делайте все тоже самое, что вы бы делали с пармезаном. Имейте в виду, что у этого вида дрожжей достаточно насыщенный вкус, не переборщите.

Пищевые неактивные дрожжи – это незаменимый ингредиент на кето-диетах, которая характеризуется продуктами с низким содержанием углеводов. Как использовать такие пищевые дрожжи на кето-диете? Добавляйте в соусы, майонезы, растительные салаты, овощные коктейли, пироги, супы (в том числе, в виде посыпки), чтобы они приобрели яркий сырный вкус.

Впрочем, независимо от диет, пивные неактивные дрожжи в хлопьях или порошке используют обычно как приправу – добавляют в любимую еду, супы, напитки, салаты и вторые блюда. Главное не увлекаться экспериментами и не испортить «сырным» вкусом дрожжей готовые блюда, ведь не везде он будет уместен.

Стоит сказать, что пищевые неактивные дрожжи также выпускаются в виде капсул и таблеток. Как их принимать? У каждого производителя своя схема приема, которой и следует придерживаться. Не забывайте читать инструкцию. Что же касается дозировки дрожжей в виде порошка или хлопьев, то она не должна превышать 2-х столовых ложек в сутки, во избежание проявления побочных эффектов.

Важный момент: для того, чтобы не спровоцировать аллергические реакции или побочные проявления со стороны пищеварительной системы, вводите неактивные дрожжи в свой рацион постепенно, со временем увеличивая размер порции.

Итак, резюмируем, пищевые неактивные дрожжи – это настоящий суперфуд, кладезь полезных веществ, которые самым наилучшим образом влияют на наш организм с самых разных сторон. Пищевые дрожжи полезны для волос, кожи, ногтей, общего укрепления организма, а также замедления процессов старения. Принимая их, вы делаете вклад в свое здоровье.

Источник

Вредные дрожжи. Правда или вымысел.

Попался мне в соцсетях такой пост:

Кандидат медицинских наук, врач-натуропат, Виктор Хрущев:

«Я исключил из своего (и своих пациентов) питания современный хлеб.

Дело в том, что если мы едим дрожжевой хлеб, то дрожжи, попадая в нашу кровь, начинают размножаться, потребляют наши витамины, микроэлементы, белки.

И в тоже время они выделяют продукты своей жизнедеятельности – токсины т. е. дрожжи паразитируют в нашем организме. И вот современный хлеб я считаю одним из самых страшных изобретений человечества.

Современные дрожжи во время выпечки уходят в капсулы из клейковины. А в кишечнике освобождаются из этих капсул и повреждают слизистую, нарушают нормальную микрофлору кишечника. Более того, они паразитируют не только в кишечнике, но в плазме крови живут и свободно размножаются (в основном почкованием).

Это может закончиться различными типами интоксикации,

грибковыми заболеваниями, нарушением иммунитета,

что может привести ко многим хроническим болезням и опухолевым процессам.

И если прекратить есть современный дрожжевой хлеб

– то, только через 5 лет мы не обнаружим дрожжевых клеток в плазме крови.

До 40-вых годов ХХ века использовались дрожжи совсем другого вида. Их еще называли «хмелевыми».

Эти дрожжи не являлись антагонистами человеческой симбиотической микрофлоры (т.е., не убивали полезных бактерий, обитающих в толстом кишечнике),

но тесто восходило около суток, что не устраивало хлебопёков.

Чтобы интенсифицировать производственный процесс,

начали использовать дрожжи совсем другого рода,

которые официально (и это открытая информация)

считаются «условно патогенными микроорганизмами»,

т.е. такими, которые вызывают заболевания при определенных условиях, это то, что сейчас называют «термофильными дрожжами».

Тесто всходит на таких дрожжах примерно за час.

Термофильные дрожжи, которые сейчас используются в хлебопечении являются АНТАГОНИСТАМИ СИМБИОТИЧЕСКОЙ МИКРОФЛОРЫ ЧЕЛОВЕКА.

Это значит, то, что выделения этих дрожжей убивают в толстом кишечнике тех микробов, которые в норме должны продуцировать витамины, незаменимые аминокислоты, полезные биологически активные вещества и многое другое, необходимое человеческому телу для полноценного функционирования, т. е. для ЗДОРОВЬЯ.

Существует около 500 видов дрожжевых грибов.

Самых опасных для человека – около 30.

В последние годы грибковыми заболеваниями болеют поголовно, почти все, причём аптечными лекарствами они не лечатся.

По различным оценкам, распространенность микозов охватывает 80% взрослого населения и 95% детского.

В последние годы отмечается тенденция к увеличению заболеваемости микозами не только у взрослых, но и у детей. Особенно сложными, системными микозами».

С интересом прочитал данную информация и призадумался, а действительно ли все так плохо? Поэтому начал рыть инет. Википедия не сильно помогла, поэтому начал искать на специфических сайтах, помешанных на здоровье людей. И там нарыл информацию, раскрывающую многие вопросы, коей и делюсь с вами.

1. Термофильные дрожжи – это пекарские дрожжи, любящие тепло, способные жить при температуре в 500 гр. Правда ли это?

2. За что же тогда зацепились журналисты, чтобы раздуть утку про дрожжи, выдерживающие высочайшие температуры?

Они зацепились и порядком переврали следующий факт: СПОРЫ отдельных грибов и бактерий могут долго выдерживать сухой жар до 120, 180 гр. (например, споры сенной палочки, термостойки споры бацилл и др.). Также в природе существуют так называемые ТЕРМОФИЛЬНЫЕ (способные быть активными при температуре от 60 гр.) БАКТЕРИИ (например, вида L. delbruckii). Но дрожжи и в частности ХЛЕБОПЕКАРНЫЕ ДРОЖЖИ вида Сахаромицес церевизее (Saccharomyces cerevisiae) к этому никакого отношения не имеют! Сейчас вы поймете почему.

Да, хлебопекарные дрожжи действительно способны размножаться спорами, но не только – гораздо чаще – почкованием. Размножение возможно в основном при температуре 25-30 градусов (есть отдельные, способные размножаться при температуре до 40, но составляют они не более 5% из 420 существующих штаммов). При этой же температуре, насыщяясь кислородом, они и выделяют углекислый газ, что вызывает брожение (соответственно, пузырьки поднимают тесто). На научном языке это будет звучать так: в кислородсодержащей среде дрожжевые клетки ферментативно окисляют сахара с выделением углекислого газа.

Споры Сахаромицес церевизее способны выдерживать температуры от 70 до 80 гр и не больше. (Вестник северо-кавказского технического университета 2006 № 2 (6). Поэтому единственный способ, каким образом споры или клетки дрожжей вида Сахаромицес (saccharomyces cerevisiae) могут оказаться в готовом хлебе – это ЕГО НЕПРОПЕКАНИЕ. Поэтому никогда не ешьте сырой, непропеченный хлеб!

3. Но почему иногда готовый пропеченый хлеб бродит, покрывается плесенью и портится?

Бывает и такое. Причина тому – несоблюдение санитарных норм на производстве или в быту как во время изготовления хлеба, так и во время его транспортировки и реализации. Если санитарные нормы были нарушены (замес теста производился грязными руками, в ненадлежащем помещении и т.п.), то в него могла попасть сенная палочка, споры любых микроскопических грибов, в том числе и переносящих температуру в 100 и более градусов. Соответственно, в мякише, где температура достигает максимум 98 гр., при выпекании споры выживут. При том, что корка хлебобулочного изделия сразу после выпечки будет стерильной.

Например, активность сенной палочки (ее споры погибают лишь при температуре 130 гр) способна вызвать тянучую болезнь хлеба (появляются тянучие нити и неприятный запах, липкость). Такой хлеб сжигают.

Ведь известно, что они вызывают процессы брожения, которые мы периодически все ощущаем? Прежде всего, мы вдыхаем споры этих грибов – они в воздухе повсюду. Также они содержатся на поверхности растений (например, споры грибов, размножающихся на клубнике, способны выдерживать температуру в 86 гр), в молочно-кислых продуктах, обитают в воде, много их в цветочном нектаре. Таким образом, если человек полностью откажется от поступления дрожжей с хлебобулочными изделиями, микробиологический видовой состав его желудка (точнее, содержимого желудка) будет содержать минимум 20 — 30 видов дрожжей тех самых сахаромицетов, но поступающих уже при дыхании и из другой пищи.

5. А правда ли, что дрожжи неблагоприятно сказываются на здоровье?

Но затронем такую животрепещущую тему как ВРЕД Saccharomyces cerevisiae. Действительно ли они могут быть вредны для организма? Да, действительно некоторые могут, если попадут в организм в активном виде. В 5% из 100% отдельные штаммы пекарных, винных, пивных дрожжей, а также дрожжей, содержащихся в пробиотиках вида Saccharomyces cerevisiae могут вызывать грибковые заболевания.

Однако грибки (в том числе и 5% Saccharomyces cerevisiae, способны поражать тело лишь больного (с имуннодефицитом) или ослабленного антибиотиками человека (когда угнетается микрофлора).

Примеры вреда, нанесенного Saccharomyces cerevisiae людям:

Так, в апреле 2003 г. 3 пациентам, находившихся в отделении реанимации госпиталя Мадрида посредством назофаренгиального зонда в течение 8,5 дней был дан препарат, содержащий пробиотик Saccharomyces boulardii (один из штаммов S.cerevisiae). После этого у пациентов развилась фунгемия.

Также в мире было зафиксировано еще 57 случаев фунгемии (нозокомиальной грибковой инфекции), которая была выявлена после потребления S.cerevisiae у тяжело больных и ослабленных людей, находящихся в реанимации, получающих энтеральное либо парентеральное питание.

Таким образом, этот микроорганизм может быть опасен людям с иммунодефицитными состояниями, а также находящихся в критическом состоянии.

Причины вспышки грибковых заболеваний в мире:

В 20 веке увеличилось количество грибковых заболеваний.

Желтая пресса поспешила приписать их увеличение Saccharomyces cerevisiae, по версии СМИшников, чуть ли ни разводимых Гитлером на костях узников концлагерей. В то же время эти дрожжи могут провоцировать лишь ничтожно малый процент грибковых заболеваний ослабленного человека по сравнению с другими видами дрожжей, которые мы вдыхаем, получаем с водой и пищей ежедневно.

Истинные причины кроются в другом. Так, увеличение грибковых заболеваний связано с появлением антибиотиков. Антибиотики способны вылечивать тяжелейшие болезни (пневмонии, сальмонеллез и др.). Однако, подавляя патогенную микрофлору, они зачастую подавляют и дружественные микроорганизмы, ранее препятствующее размножению грибов. Вот почему после курса сильных антибиотиков врачи в обязательном порядке прописывают противогрибковые препараты. Загрязнение воздуха выхлопами машин и заводов также способствует более высокой концентрации в нем грибков. Ослабленный организм не в состоянии освобождаться от их большого количества естественным путем. То же касается и антисанитарных условий в помещении, где много плесени и повышенная влажность.

6. Насколько вреден состав дрожжей хлебопекарных? Список ингредиентов в ГОСТ ужасает.

В этом нет ничего удивительного. Он действительно может ужаснуть несведущего в химии и в технологии изготовления хлеба человека.

К счастью, приведенное в этом списке – вовсе не состав дрожжей, а вещества, необходимые при их производстве. В ГОСТе четко написано следующее: «перечень основных и ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ веществ, применяемых в производстве дрожжей».

Что это значит? Это значит, что:

— 1 ЧАСТЬ перечисленных ингредиентов нужны для изготовления субстрата для дрожжей (среды, в которой будут формироваться дрожжи).

— сахара мелассы, т.е. кормовой патоки, продукта свекловичного производства, из которого дрожжи берут углерод;

— фосфаты либо фосфорная кислота – для обеспечения дрожжей фосфором;

— цинк, магний, калий для извлечения дрожжами витаминов и прочих олигоэлементов.

В СССР дрожжи получали такие необходимые им вещества, как бор, медь, цинк, молибден, йод, кобальт, марганца из микроудобрения для сельского хозяйства южных районов.

— 2 ЧАСТЬ – для создания оптимальной кислотности среды (для роста и размножения клеток) Для подкисления сусла мелассы, регулирования рН действительно применяют серную кислоту (не более 1% питательной среды) и др.

— 3 ЧАСТЬ — для обработки рук, посуды, помещений (в частности, моющее средство «Прогресс» и другие). Например, чтобы не расплодить сенную палочку, поверхности дезинфицируют р-ром хлорной извести и р-ом уксусной кислоты.

Но самое главное: по окончании выращивания дрожжей, перед прессованием их промывают от среды, в которой они выращивались. Берут пробы конечного продукта, исследуют их в лаборатории на предмет того, чтобы дрожжи не содержали ни основных, ни вспомогательных материалов. Поэтому страшен вовсе не ГОСТ, а то, что отдельные недобросовестные промышленники могут от этого ГОСТ отходить.

Поэтому страшен вовсе не ГОСТ, а то, что отдельные недобросовестные промышленники могут от этого ГОСТ отходить.

Кратко технологию производства дрожжей можно описать так: сначала идет фаза выращивания дрожжей в специальной лабораторной среде, куда постепенно вносится питание и одновременной убираются продукты жизнедеятельности. Дрожжи постепенно набирают массу, растут. За 2 недели можно вырастить 100-120 тонн дрожжевого молочка (всего из нескольких клеток). Потом дрожжевую биомассу обрабатывают: фильтруют, прессуют, высушивают или замораживают ( зависит от того, что за торговые формы нужны (жидкие либо прессованные, активные сухие, инстантные, замороженные полусухие).

7. Чем отличаются магазинные хлебопекарные дрожжи от закваски? Что лучше?

Что такое закваска? Это кусочек теста, начавший самостоятельно бродить из-за случайно попавших дрожжей из внешней среды — с водой, из миски, с мукой, с рук, с частицами пыли, а также лактобактерий. То есть, «случайные» дрожжевые клетки и молочнокислые бактерии, попав в благоприятную среду начинают активно в ней размножаться. Когда их становится много, закваску можно использовать, чтобы продолжить сбраживание основной массы теста. Поэтому хлеб на закваске тоже является дрожжевым.

Промышленные хлебопекарные дрожжи Saccharomyces cerevisiae– это чистая культура дрожжей, годами выводимая и проверяемая группой ученых для обеспечения оптимального процесса брожения.

А уж чему больше доверия – «случайным» дрожжевым клеткам, размножившимся в помещении или чистой культуры дрожжей – личное дело каждого. Будем считать, что тема «пекарские дрожжи — польза и вред» — раскрыта.

Источник

Эубикор

Эубикор — современное средство из группы пребиотиков. Биологически активная добавка к пище. Не является лекарством.

Содержание

Общая информация

В состав пребиотического комплекса Эубикор входят пищевые волокна и полностью инактивированная лечебная культура дрожжей Saccharomyces cerevisiae (vini). Пищевые волокна представляют собой сумму полисахаридов и лигнина. В процессе производства пребиотического комплекса Эубикор существенно увеличивается доля водорастворимой части пищевых волокон, а также общая площадь поверхности частиц, что многократно увеличивает эффективность применения препарата. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae (vini) инактивируются по особой технологии, благодаря которой сохраняются все наработанные в процессе их жизнедеятельности вещества (витамины, микро- и макроэлементы, аминокислоты и др.).

Механизм действия

Основной компонент пребиотического комплекса Эубикор — пищевые волокна, входящие в состав пшеничных отрубей. Поступая в кишечник они становятся пищевым субстратом для сахаролитических микроорганизмов, которые представляют собой нормальную микробиоту кишечника. К этим микроорганизмам принадлежат, в том числе и хорошо известные бифидо- и лактобактерии. В кишечнике под воздействием микробных ферментов пищевые волокна распадаются на моносахара, а затем кислоты. При этом повышается осмотическое давление в просвете толстого отдела кишечника, что сопровождается осмотическим шоком для патогенов, задержкой жидкости и увеличением объема каловых масс, усилением моторики кишечника. Образовавшиеся кислоты (молочная, уксусная, пропионовая) снижают pH содержимого толстой кишки, что еще больше усиливает перистальтику кишечника, уменьшает адгезию условно-патогенных и патогенных микробов к энтероцитам, вызывает гибель болезнетворной флоры, что уменьшает образование таких токсичных продуктов метаболизма, как аммиак, индол и скатол, а также некоторых бактериальных ферментов, обладающих потенциальной канцерогенностью (глюкуронидаза, азоредуктаза, нитроредуктаза). Растительная клетчатка, входящая в состав пищевых волокон, является мощщным сорбентом токсичных веществ эндогенного и экзогенного происхождения, а также газов, вирусов и других патогенных микроорганизмов. Пектин, содержащийся в составе пищевых волокон, образует гели, которые осуществляют захват токсинов, что является особенно ценным свойством при интоксикациях и отравлениях.

Вторым важнейшим компонентом пребиотического комплекса Эубикор являются инактивированные дрожжи Saccharomyces cerevisiae (vini). Оболочка их клеток имеет полисахаридное строение. В ее состав входят, главным образом, три олигосахарида — маннан, глюкан и гликогеноподобный компонент. Маннан и глюкан обладают способностью связывать патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, их токсины, а также являются неспецифическими стимуляторами иммунитета. Цитоплазма дрожжевых клеток богата биологически активными веществами: аминокислотами, ферментами, убихинонами, микро- и макроэлементами, витаминами А, Д3, Е, С, группы В. Указанные компоненты оказывают положительное влияние как на нормальную микрофлору, так и на организм человека в целом. В частности, дрожжевые бета-глюканы проявляют себя в качестве стимуляторов иммунного ответа [1]

Таким образом, улучшается не только микробиотические соотношения, но и функциональное и морфологическое состояние кишечника.

К настоящему времени, по данным мультицентровых исследований, высокая клиническая эффективность Эубикора подтверждена для пациентов различных возрастных категорий с СРК (Ляляева Т. В., 2003 [2] ), хроническим панкреатитом (Антонов П. Ф., 2003 [3] ), язвенной болезнью (Захарченко М. М., 2003 [4] ), гастроэзофагеальной рефлюксной болезнью (Гончар Н. В., 2004 [5] ), заболеваниями билиарной системы, хроническим, в том числе вирусным, гепатитом (Тимофеева Е. А., 2006 [6] ), внебольничной пневмонией (Крюков А. Е., 2006 [7] ), различными формами туберкулеза (Галицкий Л. А., Данцев В. В., 2004, 2008 [8] ) и многими другими.

Эубикор эффективно предотвращает развитие дисбактериоза у всех больных, получающих антибактериальную терапию. Преимуществом препарата является возможность его приема в процессе лечения антибиотиками.

Показания

Правила приёма препарата

Взрослые и дети старше 12 лет: по 1-2 пакетика по 3г.
Дети от 3 до 6 лет: 1 пакетик по 1,5 г.
Дети от 6 до 12 лет: 2 пакетика по 1,5 г.
Принимать 3 раза в день во время еды, запивая водой (150—200 мл.) или добавляя в негорячую пищу.
Продолжительность курса 3-4 недели.

Побочные реакции

Эубикор не влияет на способность концентрации внимания, что важно при управлении автомобилем и работе с механизмами. Эубикор не оказывает побочных эффектов в периоды беременности и лактации.

Противопоказания

Индивидуальная непереносимость компонентов.

Лекарственные взаимодействия

При одновременном использовании с другими препаратами рекомендуется интервал не менее 30 мин.

См. также

Источники

Примечания

Полезное

Смотреть что такое «Эубикор» в других словарях:

Эубикор — Фармакологические группы: БАДы — углеводы и продукты их переработки ›› БАДы — витаминно минеральные комплексы ›› БАДы — пробиотики и пребиотики ›› БАДы — белки, аминокислоты и их производные Состав и форма выпуска Порошок1 … Словарь медицинских препаратов

Пребиотики — Не следует путать с пробиотиками микроорганизмами, применяемыми в натуропатии. Пребиотики это компоненты пищи, которые не перевариваются и не усваиваются в верхних отделах желудочно кишечного тракта, но ферментируются микрофлорой толстого… … Википедия

Источник

Дрожжи saccharomyces cerevisiae, используемые в качестве пробиотика, и композиция на их основе

Владельцы патента RU 2490324:

Изобретение относится к штаммам дрожжей Saccharomyces cerevisiae CNCM I-3856 и Saccharomyces cerevisiae var. boulardii CNCM I-3799, используемых в качестве пробиотика, пригодного при производстве пищевых или фармацевтических композиций. Предложена также композиция, содержащая штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae CNCM I-3856 и/или Saccharomyces cerevisiae var. boulardii CNCM 1-3799 и/или по меньшей мере один из париентальных маннопротеинов EL 05 и EL 06 штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae CNCM I-3856. Изобретение способствует уменьшению боли в кишечнике, индуцированию противовоспалительного действия при отсутствии провоспалительного действия, затруднению и уменьшению адгезии и заселения желудочно-кишечного тракта бактериями, являющимися патогенными и/или имеющими инвазивный характер. 3 н.з. и 9 з.п. ф-лы, 30 ил., 6 табл., 9 пр.

Настоящее изобретение относится к области питания и здоровья человека и/или животного.

Изобретение более предпочтительно относится к новым штаммам дрожжей и новым дрожжам, получаемым исходя из новых штаммов. Такие дрожжи являются особенно полезными для комфортного состояния пищеварительного тракта и/или для предупреждения и/или лечения нарушений пищеварительного тракта человека или животного.

В литературе описано множество микроорганизмов для полезного применения у человека в пищеварительном тракте и в целях питания, см., например, WO 2006/021965.

Такие микроорганизмы традиционно обозначают термином «пробиотик», относящимся к активным микроорганизмам, способным приносить организму-хозяину пользу в отношении здоровья в том случае, когда их введение осуществляется в достаточном количестве (Joint FAO/WHO Expert Consultation Probiotics in food, FAO Food and nutrition paper Nr 85, ISBN 92-5-105513-0).

Полезный результат при пероральном введении микроорганизмов в большой степени зависит не только от штамма используемого микроорганизма, но также и от формы введения. Даже среди одного вида, в зависимости от используемых штаммов, наблюдаемые эффекты на практике очень сильно варьируют и являются иногда положительными, иногда отрицательными или нейтральными, как, например, для вида Escherichia coli, в котором можно найти как патогенные штаммы (например, типа энтеротоксиногенных или энтерогеморрагических), так и полезные штаммы, как, например, штамм Nissle 1917 (M. de Vrese; P.R. Marteau. Probiotics and Prebiotics: Effects on Diarrhea. 2007, J. Nutr., 137 (3 Suppl. 2), 803S-811S). Таким образом, в настоящее время в отношении заданного штамма невозможно предсказать, что при введении такого штамма можно рассчитывать на полезный эффект в отношении здоровья человека, и даже предусмотреть природу его возможного полезного эффекта или его интенсивность.

Некоторые штаммы микроорганизмов, в частности среди дрожжей и молочных бактерий, уже были идентифицированы в отношении некоторых случаев полезного действия на желудочно-кишечный тракт. Тем не менее, получение комплексного полезного действия на желудочно-кишечный тракт часто требует сопутствующего введения нескольких штаммов различной природы (I. Goktepe; V.K. Juneja; M. Ahmedna (eds). Probiotics in Food Safety and Human Health. 2006, CRC Taylor & Francis, ISBN 1-57444-514-6).

Кроме того, было замечено, что достаточно многие микроорганизмы, в частности молочные бактерии, обладают провоспалительным действием. Такой провоспалительный эффект может оказаться особенно вредным и нежелательным, например, в случае аутоиммунных заболеваний или иммуннодефицита.

Описаны некоторые фракции дрожжей и/или производные продукты дрожжей в отношении их полезного действия на пищеварительный тракт.

Так, например, маннопротеины, являющиеся производными продуктами дрожжей, описаны в отношении их ингибирующего действия на адгезию патогенов. Описаны также продукты клеточных стенок дрожжей в отношении их действия подобно волокнам. Однако, существует множество штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которые совсем не оказывают полезное действие или такие же эффекты.

Кроме того, в зависимости от используемых штаммов и форм вводимых дрожжей эффекты также могут очень сильно варьировать.

Таким образом, существует потребность в возможности располагать новыми штаммами микроорганизмов, которые могут оказывать полезное действие в отношении здоровья профилактически и/или терапевтически на известные или предполагаемые патологии или нарушения или на общее состояние как физического, так и психического здоровья.

Таким образом, объектом настоящего изобретения является новый штамм Saccharomyces cerevisiae, депонированный в Национальной коллекции культур микроорганизмов под № CNCM I-3856, и новый штамм Saccharomyces cerevisiae var. boulardii, депонированный в Национальной коллекции культур микроорганизмов под № CNCM I-3799.

Объектом настоящего изобретения являются также дрожжи Saccharomyces cerevisiae, полученные исходя из штамма, депонированного в Национальной коллекции культур микроорганизмов под № CNCM I-3856, и дрожжи Saccharomyces var. boulardii, полученные исходя из штамма, депонированного в Национальной коллекции культур микроорганизмов под № CNCM I-3799.

Другим объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая дрожжи Saccharomyces cerevisiae, полученные исходя из штамма, депонированного в Национальной коллекции культур микроорганизмов под № CNCM I-3856, и/или дрожжи Saccharomyces var. boulardii, полученные исходя из штамма, депонированного в Национальной коллекции культур микроорганизмов под № CNCM I-3799, и/или по меньшей мере один производный продукт дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выбранный из экстрактов дрожжей, производных продуктов клеточных стенок, париетальных глюканов, париетальных маннопротеинов, липидных фракций дрожжей, фракций нуклеиновых кислот дрожжей (РНК, ДНК).

Композиция по настоящему изобретению имеет следующие преимущества:

— способность, в частности, в сухих формах сопротивляться и выживать при переходе желудочного барьера, что позволяет оптимизировать ее действие на желудочно-кишечный тракт;

— отсутствие провоспалительного действия или очень слабое такое действие;

— способность уменьшать боли в кишечнике;

— способность затруднять и уменьшать адгезию и заселение бактериями, являющимися патогенными и/или имеющими инвазивный характер, желудочно-кишечного тракта, в частности тонкого кишечника и толстой кишки.

Такая новая композиция, обладающая такой комбинацией характеристик, до настоящего времени еще не была описана или идентифицирована.

Таким образом, данная композиция представляет собой исключительный интерес.

Другим объектом настоящего изобретения является применение упомянутой композиции для получения пищевой добавки и/или пробиотика, и/или продукта для лечебно-профилактического питания, и/или биологически активной добавки, и/или функциональных ингредиентов, и/или лечебно-косметического средства, и/или фармацевтически активного вещества, предназначенных для человека и/или животного.

В то же время настоящее изобретение относится к применению композиции, такой, как определено ранее, для получения пищевых композиций, предназначенных для улучшения комфортного состояния желудочно-кишечного тракта и/или улучшения кишечной микрофлоры.

Объектом настоящего изобретения является также применение композиции, такой, как определено ранее, для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики расстройств кишечника, функциональных нарушений кишечника или заболеваний желудочно-кишечного тракта.

Объектом настоящего изобретения является также применение композиции, такой, как определено ранее, для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики патологий или расстройств кишечника, характеризующихся состоянием гипералгезии.

Последним объектом настоящего изобретения является набор, содержащий по меньшей мере один вид дрожжей и/или по меньшей мере один производный продукт дрожжей, таких, как определено ранее, в форме, приемлемой для перорального введения.

Штамм, депонированный заявителем в соответствии с Будапештским договором в Национальной коллекции культур микроорганизмов (институт Пастера, Париж) под № CNCM I-3856, в дальнейшем описании для краткости обозначается «ScPro1».

Штамм, также депонированный заявителем в соответствии с Будапештским договором в Национальной коллекции культур микроорганизмов (институт Пастера, Париж) под № CNCM I-3799, в дальнейшем описании для краткости обозначается «SCB1».

Также для краткости производный продукт дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выбранный из экстрактов дрожжей, производных продуктов клеточных стенок, париетальных глюканов, париетальных маннопротеинов, липидных фракций дрожжей, фракций нуклеиновых кислот дрожжей (РНК, ДНК) и их смесей, в дальнейшем описании упоминается как «производное».

Под пробиотиком понимают активные микроорганизмы, которые, в случае их введения в достаточном количестве, оказывают положительное действие на здоровье, комфортное состояние и хорошее самочувствие помимо традиционных питательных эффектов.

Под продуктом для лечебно-профилактического питания или биологически активной добавкой, или функциональным пищевым продуктом, или лечебно-косметическим средством понимают пищевой продукт, который содержит ингредиенты, оказывающие полезное действие на здоровье или способные улучшить физиологические функции.

Под пищевой добавкой понимают пищевой продукт, предназначением которого является дополнение нормального пищевого режима. Пищевая добавка представляет собой концентрированный источник питательных веществ или других веществ, обладающих питательным или физиологическим действием, в том случае, когда их используют индивидуально или в комбинации в малых количествах.

Под пищевыми продуктами, предназначенными для специального питания (DDAP), понимают пищевые продукты, целью которых является особое питание, предназначенное для четко определенной группы населения, такой, как грудные дети, дети младшего возраста, спортсмены.

Пищевая композиция, такая, как упомянуто в настоящем изобретении, может представлять собой пищевую добавку или DDAP.

Штаммы по настоящему изобретению были выявлены заявителем благодаря их многочисленным преимуществам и, в частности, благодаря их способности индуцировать полезное действие на пищеварительный тракт человека и, в частности, на тонкий кишечник и толстую кишку, а также на организм в целом.

На практике было замечено, что дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные неожиданным образом способны индуцировать противовоспалительное действие в противоположность достаточно большому числу штаммов дрожжей и при этом без провоспалительного действия.

На практике дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные вызывают увеличение секреции интерлейкина IL-10, вовлеченного в противовоспалительные сигналы. Кроме того, в отличие от действия пробиотических бактерий типа лактобактерий дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные не индуцируют синтез провоспалительного цитокина IL-12. Продуцирование провоспалительных цитокинов TNFα и IFNγ также заметно меньше по сравнению с бактериальными пробиотиками. В то же время испытания позволили доказать противовоспалительный эффект in vivo дрожжей ScPro1 и, в частности, уменьшение вдвое степени воспаления толстой кишки и уменьшение на треть кишечного некроза.

Кроме того, дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные в их сухих формах способны преодолевать желудочный барьер без каких-либо отрицательных последствий на их выживаемость или их целостность, при этом данные дрожжи не внедряются во внутреннюю среду толстой кишки.

Заявителем впервые и неожиданно доказано, что дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные способны увеличивать сопротивляемость к боли, в частности, на модели с крысой in vivo.

В дополнение к данному полезному действию дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные способны ингибировать заселение и/или инвазию на уровне кишечника микроорганизмов, являющихся патогенными и/или имеющих инвазивный характер. Введение данных дрожжей вызывает уменьшение численности энтеробактерий на уровне толстой кишки и кишечной микрофлоры, устойчивой к антибиотикам.

В частности, заявителем была показана профилактическая и терапевтическая активность против заселения кишечника дрожжами Candida albicans и воспалений, провоцируемых и поддерживаемых данным патогеном. В то же время, данные дрожжи проявляют ингибирующее действие на способность к адгезии и инвазии штаммов, являющихся патогенными и/или имеющих инвазивный характер, патотипов Escherichia coli, выделенных из биопсийных материалов тонкого кишечника больных, страдающих болезнью Крона.

По настоящему изобретению дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные могут быть введены в активной или реактивируемой форме предпочтительно пероральным путем.

Под терминами «активная форма» или «активные» по настоящему изобретению понимают то обстоятельство, что дрожжи обладают активным или реактивируемым метаболизмом или способны к размножению. Речь идет, в частности, о дрожжах в сухом или свежем виде.

Как правило, дрожжи в свежем виде находятся в форме прессованных или крупитчатых дрожжей. Они могут находиться также в форме дрожжей в виде суспензии на водной основе, называемых также жидкими дрожжами. В данном случае дрожжи предпочтительно являются инкапсулированными. Способы инкапсулирования и различные типы капсул хорошо известны специалистам в данной области техники.

Среди сухих форм дрожжей можно упомянуть дрожжи, которые могут находиться в сухой быстрорастворимой или сухой активной форме. Под сухими дрожжами понимают любые дрожжи, имеющие содержание сухого вещества больше 90% и предпочтительно в интервале приблизительно от 92 до 96%.

Среди сухих дрожжей также можно упомянуть быстрозамороженные или незамороженные дрожжи со средней влажностью.

Быстрорастворимые сухие дрожжи предназначены главным образом для крупных и мелких хлебопекарных предприятий. Другие варианты применения и сбыта возможны на основе пищевого назначения (технология лекарственных форм, спиртовое брожение). Особенность данных сухих дрожжей состоит в том, что они не требуют увлажнения перед прибавлением к муке.

Данные дрожжи получают обезвоживанием дрожжей под действием градиента горячего воздуха, позволяющего превращать пастообразный продукт (прессованные или жидкие дрожжи) в продукт в виде тонкой сухой вермишели, который при этом остается активным. Затем продукт с целью обеспечения стабильности должен быть расфасован в отсутствии кислорода.

Сухие активные дрожжи представляют собой активные дрожжи, высушенные при низкой температуре с целью сохранения их ферментирующей способности и обеспечения достаточно длительного хранения. Дрожжи находятся в форме сферических частиц.

Данные дрожжи получают обезвоживанием дрожжей при совместном действии тепла и механического воздействия, которые позволяют превращать дрожжи в пастообразной форме в сухой продукт, сохраняя их жизнеспособность.

Выбранные сухие активные дрожжи получают экструзией и высушиванием в псевдоожиженном слое биомассы (активные клетки дрожжей). Такие сухие активные дрожжи, то есть сухие дрожжи, имеющие высокое содержание активных клеток дрожжей, находятся в форме гранул в общем случае с диаметром от 0,1 мкм до 2,5 мм и содержанием H₂O от 4 до 8% масс.

Такие сухие формы обладают преимуществом, состоящим в том, что они обеспечивают более хорошую гастрорезистентность по сравнению с формой свежих дрожжей и оптимизируют полезное действие дрожжей по настоящему изобретению. Дрожжи по настоящему изобретению предпочтительно находятся в форме сухих активных дрожжей.

В общем случае известно, что провоспалительные цитокины стимулируют воспалительные механизмы, которые при этом могут быть ответственными за достаточно многие клинические проблемы, в частности, в случаях аутоиммунных заболеваний или иммуннодефицита.

Так, например, дрожжи по настоящему изобретению могут быть использованы для профилактики и/или лечения как хронических, так и острых заболеваний или воспалительных расстройств кишечника, необязательно связанных с диареей или запорами.

В первом варианте осуществления настоящего изобретения расстройства и заболевания необязательно связаны с диареей.

Во втором варианте осуществления настоящего изобретения расстройства и заболевания не связаны с диареей. В частности, дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные могут быть полезными для профилактики или лечения колитов, которые характеризуются в основном воспалением толстой кишки.

В частности, данные дрожжи являются в хорошей степени приемлемыми для профилактики и/или лечения хронических воспалительных заболеваний кишечника (MICI), в частности, язвенного колита, геморрагического ректоколита, целиакии или болезни Крона.

Данные заболевания характеризуются, в частности, обостренным иммунным ответом, в который вовлечены многие воспалительные каскады. Так, например, в рамках профилактики или лечения данных заболеваний пробиотиком и/или продуктом для лечебно-профилактического питания, и/или функциональным пищевым продуктом, и/или биологически активной добавкой, и/или лечебно-косметическим средством, является важным, чтобы провоспалительные эффекты были как можно более слабыми.

Таким образом, дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные по настоящему изобретению являются наиболее предпочтительно приемлемыми для такого применения. Данные дрожжи обладают несколькими дополнительными преимуществами.

Первым преимуществом является то, что они обладают способностью увеличивать сопротивляемость к боли. Второе преимущество, в частности в случае болезни Крона, состоит в том, что данные дрожжи способны, в частности, ингибировать способность к адгезии и инвазии штаммов, являющихся патогенными и/или имеющих инвазивный характер E. coli, происходящих от больных, страдающих данным заболеванием.

Воспалительный ответ может быть, в частности, обусловлен инвазией любых патогенных микроорганизмов.

Желудочно-кишечные нарушения или заболевания могут представлять собой хронические воспалительные кишечные заболевания, такие, как язвенный колит, целиакия, болезнь Крона, геморрагический ректоколит.

Помимо того, что дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные позволяют увеличивать сопротивляемость к боли, они представляют собой также интерес для профилактики или лечения патологий или расстройств кишечника, сопровождаемых состоянием гипералгезии. Такие патологии или расстройства могут представлять собой предпочтительно функциональные кишечные расстройства, хронические воспалительные заболевания кишечника (MICI) или пищевую непереносимость (аллергии, выработка условных рефлексов и т.д.), характеризующиеся хронической висцеральной болью.

Данные дрожжи предпочтительно приемлемы для профилактики или лечения гипералгезии, в частности, синдрома раздражения кишечника (SII) любой формы (запор, диарея или их комбинация), а также хронических висцеральных болей, не относящихся к SII, таких, как функциональные абдоминальные боли без затруднений дефекации (FAPS: Functional Abdominal Pain) и боли, связанные с пищевой непереносимостью и целиакией.

Дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные, или любые композиции, содержащие их, могут быть также приемлемыми в качестве профилактики у пациентов, имеющих предрасположенность или повышенную чувствительность к нарушениям или заболеваниям такого типа, или в качестве лечения, например, в случае кризисов или в течение более длительных периодов. Композиции и способы по настоящему изобретению могут уменьшать страдания больных, ослаблять симптомы или причину таких нарушений.

Объединение действия данных дрожжей и/или их производных по настоящему изобретению на боль, воспаление и микроорганизмы, являющиеся патогенными и/или имеющие инвазивный характер, вызывает некоторым образом улучшение самочувствия, здоровья и/или комфортного состояния желудочно-кишечного тракта человека или животного.

Композиция по настоящему изобретению может содержать дрожжи ScPro1 и/или дрожжи SCB1, и/или по меньшей мере одно производное дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выбранное из экстрактов дрожжей, производных продуктов клеточных стенок, париетальных глюканов, париетальных маннопротеинов, липидных фракций дрожжей, фракций нуклеиновых кислот дрожжей (РНК, ДНК), в количестве в интервале приблизительно от 10 7 до 6·10 10 КОЕ и предпочтительно в интервале от 10 8 до 2·10 10 КОЕ или в интервале от 1 мг до 10 г и предпочтительно в интервале от 1 мг до 1 г. Такое количество может представлять собой суточное количество, принимаемое в один или несколько приемов в течение суток.

Предпочтительно дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные применяют при терапевтическом или нетерапевтическом назначении в суточной дозе в интервале от 10 7 до 6·10 10 КОЕ (колониеобразующих единиц) и предпочтительно в интервале от 10 8 до 2·10 10 КОЕ.

В случае, когда дрожжи и/или их производные находятся в активной, а не в реактивируемой форме, суточная доза, приемлемая при терапевтическом или нетерапевтическом назначении, находится предпочтительно в интервале от 1 мг до 10 г и более предпочтительно в интервале от 1 мг до 1 г. Эффективная суточная доза может быть введена в один, два, три или четыре приема.

Дрожжи и/или их производные по настоящему изобретению или композиции, содержащие их, предпочтительно вводят пероральным путем. Их количество может составлять терапевтически эффективную дозу, что означает, что по меньшей мере один из симптомов уменьшается или подавляется.

Дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные могут быть включены в пищевую композицию, предназначенную для человека или животного, и/или введены с эксципиентами или наполнителями, приемлемыми для перорального введения.

Композиция, предназначенная для питания человека, может представлять собой жидкость, пасту или твердое вещество. В частности, композиция может представлять собой молочный продукт, такой, как сыр, масло, йогурт или сливки, продукт на основе фруктов, такой, как фруктовый сок, компот или фруктовая паста, напиток или твердый пищевой продукт, например, легкие закуски, галеты, или другой продукт. Таким образом, композиция содержит дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные и компоненты пищевого продукта или напитка.

Дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные также могут быть включены в фармацевтическую композицию. Фармацевтическая композиция является приемлемой для перорального введения. Таким образом, она содержит дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные, а также соответствующую традиционную основу, выбранную из эксципиентов, разрешенных для применения в фармацевтических композициях. Композиция может быть изготовлена в виде жидкости, такой, как сироп или ампулы для питья, или в виде таблеток, желатиновых капсул, пакетиков, капсул или порошков и других приемлемых галеновых препаратов.

Кроме того, дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные могут быть введены с другими пробиотиками и/или другими функциональными ингредиентами, в частности, с пробиотическими бактериями, в частности, для наиболее полного профилактического действия.

В качестве примера можно упомянуть молочные бактерии родов Lactobacillus, Bifidobacterium, Pediococcus, Propionibacterium или Leuconostoc.

Дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные также могут быть введены с другими активными веществами, такими как антибиотики, аналгетические средства, противодиарейные средства, слабительные средства и их смеси.

Далее настоящее изобретение поясняется примерами и фигурами, приведенными в порядке пояснения и неограничительным образом:

— на фиг.1 показано изменение выживаемости дрожжей ScPro1 в пищеварительной системе, моделирующей толстую кишку человека, соответственно примеру 2;

— на фиг.2 показано действие дрожжей ScPro1 на микрофлору толстой кишки соответственно примеру 2;

— на фиг.3 и 4 показано изменение численности клеток Candida albicans в испражнениях мышей в опытах 1 и 2 примера 5, соответствующих модели профилактики (фиг.3) и лечения (фиг.4);

— на фиг.5 показана процентная доля остаточной адгезии клеток Escherichia coli AIEC LF82 на эпителиальных клетках кишечника человека в зависимости от количества дрожжей ScPro1 при предварительной инкубации; клетки дрожжей инкубировали с эпителиальными клетками кишечника в течение часа. Инфицирование клеток штаммом AIEC LF82 осуществляли в присутствии дрожжей ScPro1 соответственно примеру 6;

— на фиг.6 показана процентная доля остаточной адгезии клеток Escherichia coli AIEC LF82 на эпителиальных клетках кишечника человека в зависимости от количества дрожжей ScPro1 при совместной инкубации; клетки дрожжей и клетки Escherichia coli инкубировали одновременно с эпителиальными клетками кишечника в течение часа соответственно примеру 6;

— на фиг.7 показана оценка интенсивности воспаления кишечника мышей согласно макроскопической шкале Wallace после введения дрожжей ScPro1 и SCB1 соответственно примеру 4;

— на фиг.8 показана оценка интенсивности воспаления интестинального эпителия кишечника мышей согласно гистологической шкале Ameho после введения дрожжей ScPro1 и SCB1 соответственно примеру 4;

— на фиг.9 показана оценка интенсивности воспаления кишечника мышей согласно макроскопической шкале Wallace после введения дрожжей ScPro1 и SCB1, введенных по отдельности или в комбинации, соответственно примеру 4;

— на фиг.10 показана оценка интенсивности воспаления интестинального эпителия мышей согласно гистологической шкале Ameho после введения дрожжей ScPro1 и SCB1, введенных по отдельности или в комбинации, соответственно примеру 4;

— на фиг.11 показан уровень экспрессии иРНК гена, кодирующего белок IL-10, через один и три часа после приведения в контакт дрожжей или их производных по настоящему изобретению с эпителиальными клетками кишечника человека соответственно примеру 7;

— на фиг.12 показан уровень экспрессии иРНК гена, кодирующего нуклеарный рецептор PPARα, через один и три часа после приведения в контакт дрожжей или их производных по настоящему изобретению с эпителиальными клетками кишечника человека соответственно примеру 7;

— на фиг.13 показано модулирование экспрессии иРНК гена, кодирующего белок IL-10, через один и три часа после приведения в контакт производных дрожжей по настоящему изобретению с эпителиальными клетками кишечника человека соответственно примеру 7;

— на фиг.14 показана экспрессия гена, кодирующего белок IL-10, в эпителиальных клетках кишечника мышей после введения дрожжей и/или их производных по настоящему изобретению (пример 4);

— на фиг.15 показана экспрессия гена, кодирующего нуклеарный рецептор PPARα, в эпителиальных клетках кишечника мышей после введения дрожжей и/или их производных по настоящему изобретению (пример 4);

— на фиг.16 показано количество цитокина IL-10 в пг/мл, секретированного интестинальными клетками биопсийных материалов больных, не обязательно страдающих болезнью Крона, после приведения их в контакт с дрожжами и/или их производными по настоящему изобретению (пример 8);

— на фиг.17 показано количество цитокина TNF-α в пг/мл, секретированного интестинальными клетками биопсийных материалов больных, не обязательно страдающих болезнью Крона, после приведения их в контакт с дрожжами и/или их производными по настоящему изобретению (пример 8);

— на фиг.18 показаны результаты испытаний по определению способности связывания пили типа 1 с маннопротеиновыми фракциями (EL05 и EL06) дрожжей ScPro1;

где F означает порцию удаляемой пищи, t означает время, T означает время полувыведения пищевого продукта, а b означает параметр, описывающий форму кривой. Принятые параметры: T = 15 мин; b = 1.

Заданные значения pH:

желудок (мин/ед. pH): 0/6,0; 10/3,2; 20/2,4; 40/1,8; 60/1,6; 90/1,5; 300/1,5;

двенадцатиперстная кишка: 6,4;

подвздошная кишка: 7,2.

NaHCO₃ в трех участках тонкого кишечника;

экстракт желчи в двенадцатиперстную кишку;

экстракт поджелудочной железы в двенадцатиперстную кишку;

Удаление «малых» порций кишечного химуса осуществляли на двух уровнях TIM1 (тощая кишка и подвздошная кишка) посредством гемодиализаторов. Диализ кишечного химуса осуществляли непрерывно с солевым раствором, состав которого был близок к составу плазмы крови. Диализаты собирали в диализные мешки.

Отбор проб осуществляли в процессе пищеварения на разных уровнях тракта с целью контроля выживаемости испытуемых дрожжей.

Подсчеты численности дрожжей осуществляли соответственно традиционным микробиологическим методикам и принятому отбору проб: в желудке через 10, 20, 30 и 45 мин, на выходе из тонкого кишечника с накоплением в течение часа и в конечном остатке.

Методика подсчета изложена далее.

Для каждой отобранной пробы быстро осуществляли последовательное десятикратное разведение стерильным физиологическим раствором (NaCl, 8,5 г/л). Затем 0,1 мл каждого разведения наносили и затем распределяли по поверхности агаровой среды, разлитой в чашки Петри (две чашки на одно разведение). Чашки инкубировали в течение 48 ч при 35°C перед подсчетом «колониеобразующих единиц» (КОЕ).

Результаты подсчета выражали в КОЕ/мл (необработанные данные) и в процентном отношении клеток активных дрожжей по сравнению с числом клеток изначально введенных дрожжей для определения уровня выживаемости дрожжей в желудке и на выходе из тонкого кишечника.

В приведенной далее таблице обобщены теоретические уровни выживаемости (при 100%-й жизнеспособности) и реальные значения, полученные для каждого штамма на уровне желудка, в накопленной пробе на выходе из тонкого кишечника после 5 ч пищеварения и в накопленной пробе системы после 5 ч пищеварения.

Данные результаты хорошо демонстрируют превосходную выживаемость в желудочно-кишечном тракте дрожжей ScPro1 и SCB1.

ПРИМЕР 2. Выживаемость дрожжей ScPro1 в искусственной пищеварительной среде, моделирующей кишечник человека

Исследование выживаемости дрожжей ScPro1 во время ферментации в толстой кишке и влияние дрожжей на кишечную микрофлору

Дрожжи ScPro1 в сухой активной форме были испытаны и исследованы in vitro в искусственной пищеварительной среде, моделирующей пищеварение человека, и, в частности, путем исследования изменения и воздействия жизнеспособных испытуемых дрожжей на среду во время ферментации в толстой кишке.

Ферментация в толстой кишке является непрерывной ферментацией с последовательным поступлением среды для сохранения микрофлоры. Данная среда содержит главным образом сложные углеводные соединения, не переваренные в верхней части пищеварительного тракта (крахмал, пектин, целлюлоза т.п.), в большей или меньшей степени гидролизованные белковые соединения и муцин.

Ферментированные соединения извлекаются из среды толстой кишки также последовательно. Среда проходит через систему диализа, обеспечивающую непрерывное удаление растворимых продуктов ферментации.

Каждый цикл пищеварения включал в себя: период стабилизации микрофлоры в течение 2-3 дней после засева толстой кишки, период обработки (по меньшей мере в течение 3 дней) по меньшей мере с одной ежедневной добавкой продукта и период прекращения обработки в течение 3 дней. В каждом опыте контролировали и/или регистрировали следующие параметры:

— изменение различных аэробных и анаэробных бактериальных популяций;

— изменение основных продуктов ферментации (AGCC и газы);

— детектирование стандартной ферментативной активности;

— температура, pH и окислительно-восстановительный потенциал.

Ферментацию осуществляли в пенициллиновом флаконе вместимостью 60 мл, закрытом герметизируемой пробкой с септой и заполненном на 30 мл средой толстой кишки (культуральная среда со свежей фекальной микрофлорой). Образец дрожжей прибавляли к 30 мл среды.

Среда толстой кишки состояла, с одной стороны, из микробной суспензии, полученной из свежих испражнений, в буферном фосфатном растворе, а с другой стороны, из типичного пищевого продукта, используемого также для культивирования микрофлоры толстой кишки в искусственной толстой кишке.

После смешивания среды толстой кишки с испытуемым продуктом флакон закупоривали и герметизировали.

Для каждого продукта испытание осуществляли в двух пробах. При этом в тех же самых условиях готовили также 4 флакона с контрольными пробами (без испытуемого продукта). При этом два флакона обрабатывали немедленно (начальное время), а два флакона инкубировали так же, как и испытуемые флаконы.

Ферментацию останавливали через 24 ч, а затем флаконы обрабатывали.

Продуцирование ферментационных газов. Объем газов, образующихся при ферментации, определяли посредством системы Мариотта (принцип измерения объема воды, вытесняемой давлением газов, содержащихся в пенициллиновом флаконе). При этом анализ газов, содержащихся во флаконе, осуществляли способом CPG (H₂, CO₂, CH₄, O₂).

Продуцирование жирных кислот с короткими цепями. Осуществляли отбор первой пробы содержимого толстой кишки. Пробу или замораживали или сразу обрабатывали для определения концентрации AGCC (летучие жирные кислоты с короткими цепями) в надосадочной культуральной жидкости. Данный анализ осуществляли способом CPG. Исследованные метаболиты представляли собой уксусную, пропионовую, масляную, изомасляную, валериановую, изовалериановую, капроновую, изокапроновую и гептановую кислоты.

Микробиологический анализ. Осуществляли отбор второй пробы содержимого толстой кишки и сразу обрабатывали (последовательное десятикратное разведение восстановительной разбавляющей средой) для подсчета численности общей анаэробной, факультативной аэробно-анаэробной и грибковой микрофлоры.

Результаты по выживаемости дрожжей ScPro1 представлены на фиг.1. На данной фигуре каждая вертикальная стрелка указывает на введение дрожжей ScPro1.

Было отмечено, что дрожжи ScPro1 проявляют хорошую выживаемость до 3-го дня после введения и значительную гибель между 4-м и 7-м днями периода введения. Данное обстоятельство показывает, что дрожжи не внедряются во внутреннюю среду толстой кишки.

Результаты микробиологического анализа представлены на фиг.2. Они показывают уменьшение численности энтеробактерий в присутствии дрожжей ScPro1 с повышением после прекращения введения дрожжей. Во время введения дрожжей ScPro1 также было отмечено, что значительно уменьшилась микрофлора, устойчивая к антибиотикам (хлорамфеникол, гентамицин).

Результаты по действию дрожжей ScPro1 на продуцирование летучих жирных кислот с короткими цепями (AGCC) обобщены в приведенной далее таблице (в мМ в среде толстой кишки).

Во время обработки было отмечено уменьшение содержания ацетатов, частично в пользу пропионатов, что предполагает уменьшение активности ацетогенной микрофлоры.

Среди других контролируемых параметров не было замечено явное действие обработки на:

— продуцирование газов (по количеству и содержанию);

— общую и простую (стабильную во времени) концентрацию сахаров;

ПРИМЕР 3. Исследование влияния дрожжей ScPro1 и SCB1 на индуцирование продуцирования цитокинов

Было исследовано влияние активных дрожжей ScPro1 и SCB1 на индуцирование продуцирования цитокинов в периферических мононуклеарных клетках крови человека (PBMC).

Дрожжи ScPro1 и SCB1 были испытаны в сухой быстрорастворимой форме и сухой активной форме в отношении их способности индуцировать продуцирование цитокинов IL-10, IL-12, TNFα, TNFγ в PBMC человека.

Получение периферических мононуклеарных клеток крови человека

Свежую человеческую кровь, полученную от доноров с хорошим здоровьем в Центре гемотрансфузии, разбавляли в 2 раза PBS-Ca (GIBCO) и очищали с градиентом фиколла (GIBCO). После центрифугирования при 400 g в течение 30 минут при 20°C периферические мононуклеарные клетки крови (PBMC) образуют в сыворотке слой в форме круга. PBMC тщательно собирали аспирацией, суспендировали в 50 мл конечного объема с использованием PBS-Ca и промывали 3 раза таким же буферным раствором с центрифугированием в течение 10 минут при 20°C и 350 g. Затем PBMC снова суспендировали, используя полную среду RPMI (GIBCO), обогащенную 10% масс./об. эмбриональной телячьей сыворотки (инактивированной при 56°C в течение 30 минут), 1% масс./об. L-глутамина (GIBCO) и гентамицином (150 мкг/мл) (GIBCO). Количество PBMC подсчитывали под микроскопом, отрегулированным на концентрацию 2·10 6 клетка/мл, и распределяли (в 1 мл аликвоты раствора) по 24-луночным чашкам для культивирования клеток (Corning, Inc.).

После культивирования, осуществленного в течение ночи, Lactobacillus, Lactococcus и Escherichia coli (контрольные штаммы) промывали 2 раза буферным раствором PBS, pH = 7,2, перед последующим суспендированием в PBS с концентрацией 2·10 9 КОЕ/мл.

Инкубация периферических мононуклеарных клеток крови человека

Контрольный образец состоял из грамположительных бактерий (Lactobacillus и Lactococcus), грамотрицательных бактерий (Escherichia coli) и буферного раствора при отсутствии дрожжей.

Количественное определение цитокинов

Уровни экспрессии цитокинов определяли способом ELISA. Планшеты для анализа ELISA покрывали антителом (в течение ночи), а антитело насыщали 1%-м раствором PBS/BSA (бычьего сывороточного альбумина). Градуировочную кривую получали с известными концентрациями цитокинов с пределами обнаружения от 15,62 до 2000 пг/мл (инкубация в течение ночи). Исследование и количественное определение антицитокина производили измерением активности стрептавидина с субстратом TMB (тетраметилбензидин, Pharmingen2). Были использованы коммерческие наборы Pharmingen в соответствии с описанием изготовителя. Были выбраны четыре цитокина: 3 провоспалительных (TNFα, IFNγ, IL-12) и один противовоспалительный (IL-10).

Ответы 4 цитокинов на 5 различных доноров оценивали при соотношении «дрожжи/PBMC», равном 1/1.

Результаты количественного определения 4 цитокинов, секретированных в надосадочную культуральную жидкость, обобщены в приведенной далее таблице A. Данные представлены как среднее значение (Moy) количественного определения по 5 донорам. В таблице приведены также значения стандартной ошибки среднего значения (Sem).

1) продуцирование в случае дрожжей ScPro1 и SCB1 очень малого, в некоторых случаях не обнаруживаемого количества IL-12, индуцированного PBMC, в отличие от сравнительных бактерий;

2) существенные уровни IL-10 в обоих случаях активных дрожжей, позволившие выявить, что SCB1 имеет более хороший результат, чем ScPro1;

3) явно меньшие по сравнению с различными испытуемыми пробиотическими бактериями количества IFNγ и TNFα, секретированные под действием дрожжей ScPro1 и SCB1.

— очевидно, что дрожжи ScPro1 и SCB1 в присутствии PBMC не индуцируют экспрессию провоспалительного цитокина IL-12 в противоположность тому, что традиционно наблюдают в случае пробиотических лактобактерий;

— дрожжи ScPro1 и SCB1 в присутствии PBMC индуцируют существенные уровни IL-10 (противовоспалительного);

— количества IFN-γ и TNF-α, секретированных PBMC в присутствии дрожжей ScPro1 или SCB1, явно меньше, чем в случае пробиотических бактерий.

Пример 4. Оценка защитного действия дрожжей ScPro1 и SCB1 в случае химически индуцированного колита (TNBS) в модели с мышью

Традиционно используемая предложенная модель с животным была адаптирована для измерения противовоспалительного действия дрожжей.

В данном опыте были использованы мыши линии Balb/c в возрасте 6 недель. Мыши были акклиматизированы в условиях лаборатории в течение недели перед опытом со свободным доступом к воде и пище. Каждый образец испытывали на группе из 10 мышей. Колит индуцировали в цикле со свободным доступом к питьевой воде, содержавшей 5% (масс./об.) TNBS, в течение 7 дней. Дрожжи вводили перорально один раз в день через желудочный зонд за 3 дня до начала индуцирования колита посредством TNBS и в течение периода обработки TNBS (7 дней).

Кроме двух испытуемых групп использовали контрольную группу (негативный контроль), в которой применяли только физиологический раствор.

Параметры испытаний, полученные по результатам обработки, приведены далее.

— Макроскопическое оценивание воспаления кишечника (шкала Wallace). Толстая кишка каждой мыши была осмотрена под препаровальной лупы (5-кратное увеличение) для оценки макроскопических повреждений по шкале Wallace от 0 до 10 в зависимости от критериев оценки, характеризующих степень воспаления, таких, как гиперемия, толщина стенки толстой кишки и площадь изъязвления.

— Гистологическое оценивание воспаления (шкала Ameho). Для осуществления гистологического оценивания по шкале Ameho от 0 до 6 в зависимости от степени инфильтрации воспаления, наличия эрозии, изъязвлений или некрозов и глубины, а также распространения повреждений по поверхности использовали участок толстой кишки, отбираемый точно в 2 см от анального канала. Количественное определение деградации и повреждений кишечника осуществляли 2 независимых эксперта.

— Количественное определение экспрессии генов, кодирующих IL-10 и PPARα. С этой целью из тканей толстой кишки выделяли общую РНК посредством набора RNeasy (Macherey Nagel, Хердт, Франция) согласно инструкции изготовителя. Количественное определение информационной РНК осуществляли, используя спектрофотометр. После обработки при 37°C в течение 30 минут с 20-50 единицами препарата DNase I RNase-free (Roche Diagnostics Corporation, Индианаполис, Индиана, США) были использованы праймеры олиго-DT (Roche Diagnostics Corporation, Индианаполис, Индиана, США) для синтеза простых одноцепочечных кольцевых ДНК. Информационные РНК количественно определяли с помощью набора SYBR green Master Mix (Applera, Куртабеф, Франция) и олигонуклеотидов человека, предназначенных для исследований in vitro (см. табл. B, приведенную далее), посредством прибора GeneAmp Abiprism 700 (Applera, Куртабеф, Франция). В каждом опыте использовали эталонные и неэталонные контрольные образцы. Для каждого образца осуществляли три измерения. Интенсивность окраски препарата SYBR vert определяли с использованием программы Abiprism 7000 SDS (Applera, Куртабеф, Франция). Все результаты нормализованы по сравнению с геном, кодирующим β-актин.

Дрожжи ScPro1 и SCB1 были испытаны в описанной ранее стандартной модели профилактики. Контроль массы тела животных перед индуцированием колита показал, что композиции дрожжей, вводимые мышам, очень хорошо переносились.

Воспаление кишечника, оцененное по шкале Wallace, в случае дрожжей ScPro1 (сухая активная форма, 1 мг/сутки) и SCB1 уменьшилось на 60% по сравнению с позитивным контролем. Дрожжи SCB1 также вызывали уменьшение воспаления. Некроз кишечника, оцененный по шкале Ameho, в случае дрожжей ScPro1 (сухая быстрорастворимая форма, от 1 мг до 100 мкг/сутки) уменьшился на треть по сравнению с позитивным контролем.

Дрожжи ScPro1 и SCB1, введенные по отдельности или совместно, повысили уровень экспрессии генов, кодирующих противовоспалительный интерлейкин IL-10 и нуклеарный рецептор PPARα

На фиг.7-10 хорошо видны превосходные значения макроскопических показателей по шкалам Wallace и Ameho для дрожжей ScPro1 и SCB1 с различными суточными дозами.

На фиг.7 и 8 представлены соответственно макроскопический показатель по шкале Wallace и гистологический показатель по шкале Ameho для дрожжей для ScPro1 и SCB1 в сухой быстрорастворимой форме, вводимых ежедневно в количестве от 10 мкг до 1 мг.

Цифрами при каждом столбце графиков, показанных на фиг.7 и 8, обозначены следующие варианты:

1 означает TNBS, взятый отдельно;

2 означает TNBS + ScPro1 (1 мг);

3 означает TNBS + ScPro1 (100 мкг);

4 означает TNBS + SCB1 (1 мг);

5 означает TNBS + SCB1 (100 мкг).

Можно заметить, что дрожжи ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме, вводимые с дозой 100 мкг/сутки, в значительной степени уменьшают повреждения на макроскопическом и гистологическом уровнях.

На фиг.9 и 10 представлены соответственно макроскопический показатель по шкале Wallace и гистологический показатель по шкале Ameho для дрожжей ScPro1 и SCB1, взятых по отдельности или в комбинации в сухой быстрорастворимой форме или в сухой активной форме и вводимых ежедневно в количестве от 100 мкг до 1 мг.

На фиг.14 и 15 показаны соответственно уровни экспрессии генов, кодирующих противовоспалительный интерлейкин и нуклеарный рецептор PPARα, на уровне интестинальных клеток.

Цифрами при каждом столбце графиков, показанных на фиг.9, 10, 14 и 15, обозначены следующие варианты:

1 означает TNBS, взятый отдельно;

2 означает TNBS + ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме (100 мкг);

3 означает TNBS + ScPro1 в сухой активной форме (100 мкг);

4 означает TNBS + SCB1 в сухой активной форме (100 мкг);

5 означает TNBS + ScPro1 в сухой активной форме (1 мг);

6 означает TNBS + ScPro1 в сухой активной форме (100 мкг);

7 означает TNBS + ScPro1 в сухой активной форме (100 мкг) + SCB1 (100 мкг).

Можно отметить, что дрожжи ScPro1 в сухой активной форме в значительной степени вызывают повреждения на макроскопическом уровне и существует синергический противовоспалительный эффект комбинации ScPro1 и SCB1 как на макроскопическом уровне, так и на гистологическом уровне.

Дрожжи ScPro1 и SCB1 повысили соответственно в 2,9 и 3,1 раза уровень экспрессии гена, кодирующего противовоспалительный интерлейкин IL-10, при дозах 100 мкг. Комбинация ScPro1 + SCB1 (столбец № 7) повысила в 2,7 раза данный уровень экспрессии (фиг.14).

Дрожжи ScPro1 и SCB1 повысили соответственно в 1,5 и 1,6 раза уровень экспрессии гена, кодирующего нуклеарный рецептор PPARα, при дозах 100 мкг. Комбинация ScPro1 + SCB1 (столбец № 7) повысила в 1,7 раза данный уровень экспрессии (фиг.15).

ПРИМЕР 5. Исследование влияния дрожжей ScPro1 и SCB1 на заселение дрожжами Candida albicans на уровне кишечника в случае химически индуцированного воспаления в модели с мышью

Целью исследования является определение эффектов введения дрожжей ScPro1 и SCB1 пробиотического типа на заселение кишечника патогенными дрожжами Candida albicans и его эффект потенцирования воспаления в случае химически индуцированного колита в модели с мышью.

Испытуемые дрожжи приняты в сухой быстрорастворимой форме.

Мыши-самки линии Balb/C имели возраст от 4 до 6 недель. Со дня J0 до дня J14 животные получали DSS (Dextran Sodium Sulfate (сульфат декстраннатрия) с концентрацией 1,5% в питьевой воде для химического индуцирования воспаления.

Было осуществлено три опыта.

В первом опыте со дня J5 мышам через канюлю вводили 5·10 7 клеток дрожжей ScPro1 в 200 мкл PBS (буферный фосфатный раствор). Данную процедуру повторяли ежедневно в течение 19 дней. В день J0 мышам через канюлю вводили 5·10 7 клеток дрожжей штамма C. albicans SC5314 в 200 мкл PBS.

Во втором опыте в день J0 мышам через канюлю вводили 5·10 7 дрожжевых клеток штамма C. albicans SC5314 в 200 мкл PBS. Через 4 дня части мышей через желудочный зонд вводили по 5·10 7 клеток дрожжей ScPro1 в 200 мкл PBS. Данную процедуру повторяли ежедневно в течение 14 дней.

В третьем опыте в день J0 мышам через канюлю вводили 5·10 7 клеток дрожжей штамма C. albicans SC5314 в 200 мкл PBS. Через час части мышей через желудочный зонд вводили по 5·10 7 клеток дрожжей ScPro1 в 200 мкл PBS. Данную процедуру повторяли ежедневно в течение 14 дней.

Животных (участвовавших в опытах 1, 2 и 3) ежедневно контролировали по следующим показателям:

— консистенция испражнений, анальное кровотечение, масса тела (клинический показатель);

— ретрокультивирование 1 мг испражнений, гомогенизированных в 1 мл PBS, 10 мкл которого засевали на среду Candi-select; после культивирования в течение 24 ч при 37°C подсчитывали КОЕ C. albicans (окрашенных в синий цвет) и S. cerevisiae (окрашенных в зеленый цвет);

Как можно видеть на фиг.3, в первом опыте (испытание на профилактическое действие) в данной модели химически индуцированного колита наблюдается, что введение DSS в значительной степени увеличивает заселение слизистых оболочек кишечника дрожжами C. albicans, начиная с дня J4 (DSS + Ca). Представляет большой интерес, что введение пробиотических дрожжей ScPro1 в течение 19 дней в значительной степени уменьшает заселение дрожжами C. albicans, индуцированное посредством DSS.

Как видно из фиг.4, во втором опыте (испытание на терапевтическое действие) наблюдается, что введение пробиотических дрожжей ScPro1 или SCB1 уменьшает заселение, индуцированное посредством DSS. Кроме того, действие дрожжей ScPro1 заметно даже после прекращения обработки посредством DSS в день J14.

Из изложенного следует, что введение дрожжей ScPro1 или дрожжей SCB1 в значительной степени уменьшает заселение дрожжами C. albicans, причем как в условиях профилактики, так и в условиях терапии. Следует заметить, что такое защитное действие продолжается даже после прекращения терапии.

ПРИМЕР 6. Исследование ингибирующего действия дрожжей ScPro1 или SCB1 или их производных на способность к адгезии и инвазии патогенных штаммов E. coli, выделенных из биопсийных материалов тонкого кишечника больных, страдающих болезнью Крона

Влияние активных дрожжей ScPro1, SCB1 и их производных было исследовано в отношении их ингибирующего действия на способность к адгезии и инвазии патогенных штаммов E. coli, выделенных из биопсийных материалов тонкого кишечника больных, страдающих болезнью Крона.

Штаммы E. coli, сокращенно называемые AIEC от Adherent-Invasive E. coli и выделенные из биопсийных материалов тонкого кишечника больных, страдающих болезнью Крона (MC), способны прикрепляться и захватывать эпителиальные клетки кишечника.

Штамм E. coli LF82, выделенный из хронически поврежденного участка тонкого кишечника у больного, страдающего болезнью Крона, обладает всеми характеристиками инвазивного бактериального патогена. Характеристика фенотипа «адгезия-инвазия» штамма LF82 и отсутствие генетических определителей инвазии, уже описанных у E. coli, Shigella и Salmonella, привело к детерминированию существования новой патогенной группы E. coli, которая может быть связана с болезнью Крона и обозначена AIEC. После фагоцитоза макрофагами мыши или человека штамм AIEC LF82 выживает и размножается в широкой вакуоли, при этом сохраняя целостность клетки-хозяина. В ответ на инфекцию макрофаги секретируют значительное количество TNFα. Степень распространения штаммов AIEC на уровне повреждений тонкого кишечника больных, страдающих MC, равна 36,4%.

Процесс адгезии бактерии на клетках эукариотов является результатом специфического взаимодействия между лигандом, присутствующим на поверхности бактерии и называемым адгезином, и рецептором протеиновой, гликопротеиновой или гликолипидной природы, экспрессируемым на поверхности эпителиальной клетки-хозяина. Касательно бактерий было доказано, что адгезин FimH пили типа 1 вовлечен в адгезию бактерий AIEC на эпителиальных клетках кишечника. Бактериальный адгезин FimH распознает энтероцитарный рецептор CEACAM6 (называемый также CD66c или NCA), представляющий собой гликопротеин, богатый остатками маннозы и аномально сверхэкспрессируемый на уровне тонкого кишечника у 90% больных, страдающих MC.

В качестве штамма-прототипа был использован штамм AIEC LF82, отличающийся своей способностью к адгезии и инвазии на эпителиальных клетках кишечника в культуре.

Данное исследование было проведено также с 10 штаммами AIEC, выделенными у больных, страдающих MC, для подтверждения результатов, полученных со штаммом AIEC LF82.

Штамм E. coli DAEC (Diffuse Adherent Escherichia Coli) C1845, который прикрепляется к эпителиальным клеткам по механизму, не зависящему от маннозы (адгезины Afa/Dr), был использован в качестве негативной контрольной пробы.

Испытания на агглютинацию

С активными дрожжами ScPro1 и SCB1 были осуществлены испытания на количественную агглютинацию как в присутствии бактерий AIEC, так и в присутствии экстрактов очищенных пили типа 1, полученных исходя из штамма AIEC LF82 согласно методике, описанной Boudeau и соавт. (2001, Mol. Microbiol. 39:1272-84). Индекс агглютинации определяли по фиксированной концентрации дрожжей и переменной концентрации бактерий или очищенных пили типа 1.

В случае фракций дрожжей маннопротеинового типа, для которых не наблюдается агглютинация, определение способности связывания пили типа 1 осуществляли способом ELISA.

Такие испытания традиционно осуществляют в микропланшетах. Фракции дрожжей фиксируют на микропланшете. Различные разведения очищенных пили типа 1 приводят в контакт с фракциями дрожжей. После промывок пили типа 1 открывают посредством антител анти-пили типа 1, полученных от кролика (Boudeau и соавт., 2001). После промывки используют вторичные антитела, связанные с пероксидазой. Количественное определение осуществляют с помощью субстрата пероксидазы (H₂O₂) и хромогена (тетраметилбензидина) путем измерения оптической плотности на микропланшетном фотометре при 450 нм.

Испытания на ингибирование взаимодействия бактерий AIEC с рецептором CEACAM6, экспрессируемым на поверхности эпителиальных клеток кишечника, дрожжами ScPro1 или SCB1

Для испытания на ингибирование in vitro (предварительная и совместная инкубация) были взяты недифференцированные эпителиальные клетки кишечника T84, в значительной степени экспрессирующие рецептор CEACAM6. Клетки T84 культивировали в атмосфере с 5% CO₂ при 37°C в щелочной среде DMEM (среда Игла в модификации Дульбекко), дополненной 50% Ham-F12 (Life Technology) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки, декомплементированной при нагревании. К данной среде прибавляли 1% аминокислот, не являющихся незаменимыми (Life Technology), 1% глутамина (Life Technology), 200 ед./л пенициллина, 50 мг/л стрептомицина, 0,25 мг/л амфотерицина B и 1% смеси витамин X-100 для среды MEM (Minimum Essential Medium) (Life Technology). Клетки засевали из расчета 4·10 5 клеток на лунку в 1 мл и инкубировали в течение 48 ч при 37°C в атмосфере с 5% CO₂. Затем слой клеток T84 промывали раствором PBS и далее в каждую из лунок прибавляли 1 мл инфицируемой среды (DMEM/F12 + 10% SVF). Бактериальную суспензию в PBS с оптической плотностью DO₆₂₀, равной 0,1, готовили исходя из штамма AIEC LF82, культивированного в течение ночи при 37°C в бульоне Луриа-Бертани (LB). Клетки T84 инфицировали мультиплетным источником инфекции (MOI) из расчета 10 бактерий на 1 клетку, прибавляя 25 мкл бактериальной суспензии с оптической плотностью DO₆₂₀, равной 0,1, к инфицируемой среде. Планшет на 24 лунки инкубировали в течение 3 ч при 37°C в атмосфере, обогащенной CO₂. Определение остаточной адгезии и остаточной инвазии бактерий осуществляли соответственно описанному далее.

Осуществляли опыт с клетками CHO-K1, не экспрессирующими CEACAM6, и такими же генетически модифицированными клетками, стабильно экспрессирующими CEACAM6 (CHO-K1/CEACAM6). Клетки CHO-K1 культивировали в среде DMEM/F12, содержавшей 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% L-глутамина, 200 ед./л пенициллина, 50 мг/л стрептомицина и 0,25 мг/л амфотерицина B. Клетки CHO-K1 культивировали в среде DMEM/F12, содержавшей 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% L-глутамина и 600 мкг/л гигромицина. Клетки засевали в 24-луночный планшет из расчета 2·10 5 клеток на лунку. После инкубации в течение 7-8 ч при 37°C среду заменяли новой культуральной средой, дополненной 5 мкМ бутирата натрия, для индуцирования экспрессии CEACAM6. Для контролирования экспрессии белка CEACAM6 трансфицированными клетками осуществляли вестерн-блоттинг.

После инкубации в течение 20-24 ч при 37°C клетки инкубировали с возрастающими концентрациями штамма дрожжей ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме в течение 1 ч (опыт предварительной инкубации), затем их инфицировали посредством MOI 20 (4·10 6 бактерий на лунку) для соблюдения соотношения «бактерии/дрожжи», использованного ранее при проведении испытаний с клетками T84. После инкубации в течение 3 ч при 37°C прикрепленные бактерии подсчитывали в отсутствии или в присутствии дрожжей соответственно описанному далее.

В другом опыте использовали операционный материал, полученный от больных. Энтероциты, полученные из биопсийных материалов тонкого кишечника 3 больных, страдающих болезнью Крона, промывали раствором PBS и затем предварительно инкубировали в пробирке Эппендорфа вместимостью 2 мл в 1 мл среды DMEM, содержавшей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, в присутствии 0, 1,25, 2,5 или 5 мг/мл штамма дрожжей ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме. Содержимое пробирки перемешивали вращением в течение 15 мин при 37°C, затем энтероциты инфицировали в присутствии дрожжей 50 мкл культуры в среде LB в течение ночи штаммом AIEC LF82. Далее осуществляли инкубацию в течение 3 ч при перемешивании. Энтероциты промывали 2 раза раствором PBS, затем наносили между предметной пластиной и покровным стеклом и наблюдали с помощью фазоконтрастной микроскопии. Подсчеты бактерий, прикрепленных к щеточной каемке энтероцитов, осуществляли в отсутствии или в присутствии дрожжей. Опыт осуществляли также с не имеющим пили мутантом LF82-delta fimH для определения базального уровня адгезии бактерий AIEC, не распознающих пили типа 1 рецепторами CEACAM6. Испытания на ингибирование адгезии были проведены также в присутствии антитела анти-CEACAM6.

Методика анализа для определения остаточной адгезии и остаточной инвазии бактерий на эпителиальных клетках кишечника T84

Клеточный слой промывали раствором PBS 4 раза по 1 мл, затем клетки подвергали лизису путем инкубации в течение 5 мин при комнатной температуре с 500 мкл 1%-го раствора Triton X-100 в дистиллированной воде. Лизаты разбавляли и затем наносили на агар LB-Agar для определения числа КОЕ, соответствующего числу прикрепленных бактерий.

Для подсчета инвазивных бактерий клеточный слой промывали раствором PBS через 3 ч после инфицирования, затем в течение 1 ч инкубировали 1 мл инфицированной среды, содержавшей 100 мкг/мл гентамицина для уничтожения внеклеточных бактерий. Инвазивные бактерии подсчитывали после лизиса клеток, последовательных разведений и нанесения на агар LB-agar.

Уровни адгезии и инвазии штамма AIEC LF82 анализировали по сравнению с клетками, инфицированными штаммом AIEC LF82 и не подвергавшимися какой-либо обработке дрожжами или производными дрожжей.

Все результаты выражены соответственно соотношению R:

R = число прикрепленных или инвазивных бактерий в присутствии дрожжей ScPro1/число прикрепленных или инвазивных бактерий в отсутствии обработки.

Методика 1. Модель совместной инкубации

Клетки T84 и суспензию бактерий получали соответственно методике, описанной ранее в испытании на адгезию и инвазию. Дрожжи или производные дрожжей суспендировали в PBS с определенной концентрацией и 25 мкл такой суспензии прибавляли к инфицируемой среде клеток T84 (1 мл). Затем клетки сразу инфицировали бактериальным штаммом MOI 10. Смесь «суспензия бактерий/дрожжи, инкубированные в присутствии клеток» гомогенизировали, а затем 24-луночный планшет инкубировали в течение 3 ч при 37°C. Уровни адгезии и инвазии бактериального штамма определяли соответственно описанному ранее и при этом в отсутствии и в присутствии дрожжей или экстрактов дрожжей при инфицировании. Соотношение между уровнем бактериальной адгезии или инвазии в отсутствии дрожжей (100%) и уровнем бактериальной адгезии или инвазии в присутствии дрожжей представляет собой уровень остаточной адгезии или остаточной инвазии бактерий.

Методика 2. Модель преварительной инкубации

Клетки T84 и суспензия бактерий получали соответственно методике, описанной ранее в испытании на адгезию и инвазию. Суспензию дрожжей или производных дрожжей прибавляли к инфицируемой среде (1 мл) клеток T84 в объеме 25 мкл. Суспензию дрожжей гомогенизировали, а затем инкубировали в течение 1 ч при 37°C в 24-луночном планшете для культивирования клеток. После данной инкубации клетки T84 инфицировали бактериальным штаммом MOI 10 в присутствии дрожжей в течение 3 ч при 37°C. Подсчет прикрепленных и инвазивных бактерий осуществляли соответственно описанному ранее в присутствии или в отсутствии дрожжей для определения процентной доли остаточной адгезии или остаточной инвазии, при этом 100% означает адгезию или инвазию в отсутствии дрожжей.

— Верификация экспрессии CEACAM6

Иммуноцитохимическую маркировку осуществляли для каждой партии культивированных клеток для проверки наличия и оценивания количества экспрессированного CEACAM6. Клетки культивировали на стерильных стеклянных пластинах. Клеточный слой промывали раствором PBS, затем фиксировали 3%-м параформальдегидом при pH = 7,4 в течение 10 минут при комнатной температуре. Клетки инкубировали с моноклональным антителом анти-CEACAM6 (клон 9A7, Genovac), разбавленным в соотношении 1/100 смесью «PBS-5% лошадиной сыворотки», во влажной атмосфере в течение часа. После промывки раствором PBS клетки приводили в контакт с вторичным антителом, связанным с флуорохромом (анти-мышиный FITC, Zymed) и разбавленным в соотношении 1/500 смесью «PBS-5% лошадиной сыворотки», в течение 1 часа во влажной атмосфере. Стеклянные пластины фиксировали на предметном стекле Moewiol и затем визуализировали с помощью флюоресцентного микроскопа.

— Проверка отсутствия клеточной цитотоксичности

Отсутствие клеточной цитотоксичности, индуцированной различными дозами дрожжей, проверяли количественным анализом лактатдегидрогеназы (LDH) в инкубационной среде «дрожжи/клетки» или «FDL/клетки» (Glasser и соавт., 2001).

Испытания на агглютинацию с LF82

Титры агглютинации, полученные с LF82 в присутствии дрожжей ScPro1 или SCB1 в культуре (= свежем виде) или в сухом виде (высушивание до сухой быстрорастворимой или лиофилизованной формы), обобщены в приведенной далее таблице, в которой представлены результаты от 3 до 5 независимых опытов.

Были получены достоверно хорошие результаты агглютинации с LF82 в случае сухих дрожжей ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме и SCB1 в сухой быстрорастворимой форме.

Для данных дрожжей была доказана значимость благоприятного воздействия способа и, в частности, способа сушки на их потенциал агглютинации.

Испытания на агглютинацию с очищенными пили

Титры агглютинации, полученные с очищенными пили в присутствии дрожжей ScPro1 в культуре (= свежем виде) или в сухой быстрорастворимой форме и дрожжей SCB1 (в сухой форме) обобщены в приведенной далее таблице.

Данное испытание подтверждает, что для агглютинации в значительной степени необходимо взаимодействие «пили-дрожжи». Учитывая, что пили необходимы для распознавания маннозных структур, именно последние распознаются у дрожжей и принимают участие в наблюдаемом феномене агглютинации. Лучшие результаты получены в случае дрожжей ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме.

Результаты испытаний по определению способности связывания пили типа 1 с маннопротеиновыми фракциями дрожжей ScPro1

На фиг.18 ясно показано, что очищенные пили типа 1, полученные из штамма AIEC LF82, специфически фиксируются на маннопротеинах дрожжей. Следует заметить, что способ получения (термический или ферментативный) таких маннопротеинов (EL05 и EL06) оказывает незначительное влияние на константу сродства к пили.

Результаты по ингибированию взаимодействия бактерий AIEC с рецептором CEACAM6, экспрессируемым на поверхности эпителиальных клеток кишечника

1/ Распределение образцов дрожжей или производных дрожжей по способности ингибирования адгезии и инвазии штамма AIEC LF82 на эпителиальных клетках кишечника T84 в модели совместной инкубации.

Были исследованы дрожжи ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме (3,09·10 7 клетка/мг), ScPro1 в сухой форме (1,86·10 7 клетка/мг) и SCB1 в сухой быстрорастворимой форме (5,83·10 7 клетка/мг), а также маннопротеины дрожжей EL05 (в сухой форме).

В качестве сравнительного образца прибавляли дрожжи Ultra-levure ® (Biocodex, 2,054·10 7 клетка/мг).

Сравнение ингибирующей способности дрожжей с одинаковым количеством дрожжей в модели совместной инкубации

После промывки раствором PBS и центрифугирования в течение 15 мин при 7500 об/мин образцы дрожжей снова суспендировали в PBS с концентрацией 4·10 8 клетка/мл. Разведение дрожжей в PBS осуществляли с соотношением 1/2, 1/10, 1/20 и 1/100.

Было осуществлено три независимых опыта согласно методике 1. Результаты на фиг.19A и 19B (остаточная адгезия и остаточная инвазия) представлены в виде средних значений уровней остаточной адгезии и остаточной инвазии и интервалов ошибки, соответствующей стандартной ошибке среднего значения.

На фиг.19A и 19B показаны следующие полученные результаты:

— дрожжи ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме и ScPro1 в сухой форме сильно ингибируют адгезию штамма LF82 на клетках T84 в зависимости от дозы. Ингибирование дрожжами ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме в количестве 5·10 5 клетка/мл является более значительным по сравнению с дрожжами ScPro1 в сухой форме в количестве 5·10 6 клетка/мл;

— дрожжи SCB1 в сухой быстрорастворимой форме ингибируют адгезию менее сильно, чем 2 других образца дрожжей: остаточная адгезия при дозе 1·10 7 клетка/мл составляет 45,7% по сравнению с 18,7 и 8% остаточной адгезии для штаммов ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме и ScPro1 в сухой форме соответственно;

— дрожжи ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме значительно ингибируют инвазию клеток T84 штаммом AIEC LF82 при дозе 1·10 5 клетка/мл. При дозе 1·10 7 клетка/мл уровень остаточной инвазии составляет 16,3%;

— для дрожжей ScPro1 в сухой форме и SCB1 в сухой быстрорастворимой форме ингибирующее действие является более медленным при дозе 1·10 6 и 5·10 6 клетка/мл соответственно.

Испытания на ингибирование маннопротеинами EL05 в модели совместной инкубации

Маннопротеины дрожжей EL05 суспендировали в PBS с концентрацией 160 мг/мл. Осуществляли последовательные разведения в PBS с соотношением 1/2, 1/4, 1/8 и 1/40 и прибавляли 25 мкл каждой суспензии маннопротеинов к инфицируемой среде согласно методике 1.

Было осуществлено три независимых опыта. Результаты, показанные на фиг.20A и 20B (остаточная адгезия и остаточная инвазия), представлены в виде средних значений уровней остаточной адгезии и интервалов ошибки, соответствующей стандартной ошибке среднего значения.

На данных фигурах показано, что маннопротеины дрожжей EL05 обладают способностью ингибирования адгезии и инвазии штамма AIEC LF82 на клетках T84 в зависимости от дозы в модели совместной инкубации.

2/ Распределение образцов дрожжей или производных дрожжей по способности ингибирования адгезии и инвазии штамма AIEC LF82 на эпителиальных клетках кишечника T84 в модели предварительной инкубации.

В модели предварительной инкубации были использованы такие же образцы дрожжей и фракций, что и в модели совместной инкубации.

Сравнение ингибирующей способности дрожжей с одинаковым количеством дрожжей в модели предварительной инкубации

После промывки раствором PBS и центрифугирования в течение 15 мин при 7500 об/мин образцы дрожжей снова суспендировали в PBS с концентрацией 4·10 8 клетка/мл. Разведение дрожжей в PBS осуществляли с соотношением 1/2, 1/10, 1/20 и 1/100. Было осуществлено три независимых опыта согласно методике 2.

Результаты, показанные на фиг.21A и 21B (остаточная адгезия и остаточная инвазия), представлены в виде средних значений уровней остаточной адгезии и остаточной инвазии и интервалов ошибки, соответствующей стандартной ошибке среднего значения.

Предварительная обработка клеток T84 дрожжами обеспечивает значительное ингибирование адгезии штамма LF82 при дозе 5·10 6 клетка/мл штамма ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме и ScPro1 в сухой форме. Тем не менее, в случае дрожжей SCB1 в сухой быстрорастворимой форме с такой дозой какого-либо значительного ингибирования не было замечено.

Предварительная обработка клеток T84 дрожжами обеспечивает ингибирование инвазии штамма LF82 при дозе 1·10 5 клетка/мл штамма дрожжей ScPro1 в сухой форме.

При дозе 5·10 5 клетка/мл 3 образца дрожжей индуцируют значительное уменьшение инвазии штамма LF82.

Испытания на ингибирование маннопротеинами EL05 в модели предварительной инкубации

Маннопротеины дрожжей EL05 суспендировали в PBS с концентрацией 160 мг/мл. Осуществляли последовательные разведения в PBS с соотношением 1/2, 1/4, 1/8 и 1/40 и прибавляли 25 мкл каждой суспензии маннопротеинов к инфицируемой среде согласно методике 2. Было осуществлено три независимых опыта. Результаты, показанные на фиг.22A и 22B (остаточная адгезия и остаточная инвазия), представлены в виде средних значений уровней остаточной адгезии и интервалов ошибки, соответствующей стандартной ошибке среднего значения.

Таким образом, маннопротеины EL05 позволяют ингибировать в зависимости от дозы адгезию и инвазию штамма LF82 при концентрации 2 мг/мл.

Результаты испытаний на ингибирование дрожжами адгезии штамма AIEC LF82 в случае CHO-K1, экспрессирующих или не экспрессирующих рецептор CEACAM6, в модели предварительной инкубации

Было осуществлено пять независимых опытов согласно упомянутой ранее методике 2.

На фиг.23 показано, что наблюдается значительное ингибирование адгезии штамма AIEC LF82 на клетках CHO/CEACAM6 при предварительной инкубации с 25 мкг/мл дрожжей. В случае таких клеток замечено ингибирующее действие в зависимости от дозы.

Адгезия штамма AIEC LF82 также наблюдается на клетках CHO-K1, что несомненно обусловлено экспрессией маннозосодержащих белков, экспрессируемых на поверхности таких клеток. Однако, предварительная инкубация штамма LF82 с дрожжами ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме не обеспечивает ингибирование в значительной степени адгезии на нетрансфицированных клетках.

Таким образом, данное обстоятельство свидетельствует, что дрожжи воздействуют на адгезию штамма LF82 с рецепторами CEACAM6, экспрессируемыми клетками.

Результаты ингибирования адгезии штамма AIEC LF82 на уровне щеточной каемки энтероцитов больных, страдающих болезнью Крона, в модели предварительной инкубации

На фиг.24 показаны средние индексы адгезии, полученные в ходе эксперимента и рассчитанные в присутствии или в отсутствии возрастающих концентраций дрожжей ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме (мг/мл) или в присутствии антитела анти-CEACAM6. По результатам, представленным на данной фигуре, можно констатировать зависящее от дозы значительное уменьшение адгезии штамма AIEC LF82 к щеточной каемке энтероцитов больных в случае присутствия штамма дрожжей ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме. При дозе дрожжей 5 мг/мл остаточная адгезия штамма AIEC LF82 подобна адгезии, наблюдаемой в присутствии антитела анти-CEACAM6, или адгезии, наблюдаемой в случае мутанта, лишенного пили типа 1.

Из данного исследования вытекает, что:

— дрожжи ScPro1 и SCB1, в частности, в сухой быстрорастворимой форме проявляют большую способность агглютинации штамма LF82;

— дрожжи ScPro1 и SCB1 способны ингибировать in vitro адгезию и инвазию эпителиальных клеток человека (T84, энтероциты из биопсийных материалов тонкого кишечника) и клеток CHO, экспрессирующих рецептор CEACAM6 человека, в случае бактерий E. coli в зависимости от дозы;

— маннопротеины способны ингибировать in vitro адгезию и инвазию эпителиальных клеток человека (T84, энтероциты из биопсийных материалов тонкого кишечника) и клеток CHO, экспрессирующих рецептор CEACAM6 человека, в случае бактерий E. coli в зависимости от дозы;

— in vitro дрожжи ScPro1 способны в больших концентрациях частично защищать приблизительно 80% клеток, инфицированных бактериями.

ПРИМЕР 7. Исследование регуляторной роли дрожжей ScPro1, SCB1 и производных дрожжей в экспрессии генов, кодирующих IL-10 и PPARα, в эпителиальных клетках кишечника человека, культивируемых in vitro

Был исследован пробиотический характер дрожжей ScPro1 и SCB1, вводимых по отдельности или в комбинации, и/или фракций дрожжей и их способность ингибировать возникновение воспаления за счет взаимодействия с некоторыми кишечными рецепторами.

Испытания in vitro

В частности, было исследовано действие дрожжей и производных дрожжей по настоящему изобретению на различные рецепторы эпителиальных клетках кишечника путем анализа in vitro двух линий клеток рака толстой кишки CaCo-2 (ATCC HTB-37) и HT-29 (ATCC HTB-38).

С этой целью осуществляли транскрипционный анализ путем экстракции РНК по приведенной далее методике.

Клетки подвергали лизису в тризоле. Затем с растворимой фракцией осуществляли стадию с дезоксирибонуклеазой, прибавляя 200 мкл раствора, содержавшего 10 единиц ингибитора рибонуклеазы и 10 единиц дезоксирибонуклеазы.

10 мкг РНК были ретротранскрибированы в присутствии 200 единиц инверсной транскриптазы, дитиотреитола, олиго-dT15 и дезоксирибонуклеотидов.

Амплифицировали кДНК по известной методике конкурентной полимеразной цепной реакции (по-английски PCR, Polymerase Chain Reaction), используя специфические смысловые и антисмысловые затравки, в частности, гены, такие, как IL-10 и PPARα.

После 40 циклов амплификации, осуществленных в присутствии 1,25 единицы Ampli Taq Gold 5000, и разделения различных образцов на 3%-м геле агарозы интенсивность полос определяли с помощью диссектора.

Результаты выражены как число молекул иРНК на 10 5 молекул β-актина в качестве внутреннего стандарта.

Результаты, приведенные на фиг.11, представляют собой значения экспрессии иРНК через час (индекс A) и через 3 часа (индекс B) после приведения в контакт дрожжей или их производных с эпителиальными клетками кишечника, экспрессирующими ген, кодирующий противовоспалительный белок IL-10.

На фиг.11 цифрами обозначены испытанные дрожжи/производные дрожжей, которые показали уровень быстрой экспрессии, превышающий 4-кратный сравнительный сигнал:

3 означает дрожжи Saccharomyces cerevisiae;

5 означает дрожжи ScPro1 по настоящему изобретению;

6 означает экстракт дрожжей Saccharomyces cerevisiae;

12 означает фракцию РНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Данные результаты хорошо демонстрируют, что дрожжи и производные дрожжей Saccharomyces cerevisiae по настоящему изобретению индуцируют быструю экспрессию, уже через час, гена, кодирующего противовоспалительный цитокин IL-10.

Действительно, по сравнению с необработанным контрольным образцом экспрессия иРНК в случае дрожжей и их производных по настоящему изобретению превышает 4-кратное значение по оси ординат, которое уже соответствует превосходному уровню быстрой экспрессии.

Другие результаты представлены на фиг.13. На данной фигуре показано изменение в зависимости от количества внесенных производных дрожжей экспрессии иРНК гена, кодирующего белок IL-10.

Показанные на фиг.13 значения экспрессии были измерены через час (1 ч) и через три часа (3 ч). Варианты экспрессии в случае дрожжей и экстрактов дрожжей Saccharomyces cerevisiae по настоящему изобретению обозначены цифрами:

5 означает дрожжи ScPro1 по настоящему изобретению;

6 означает экстракт дрожжей Saccharomyces cerevisiae;

8 означает париетальный β-глюкан Saccharomyces cerevisiae;

9 означает париетальный маннопротеин дрожжей Saccharomyces cerevisiae;

11 означает фракцию ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae;

12 означает фракцию РНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Экспрессию измеряли при различных концентрациях дрожжей и/или их производных.

Чем темнее цвет столбца на фиг.13, тем больше концентрация дрожжей/производного.

Результаты, представленные на фиг.13, показывают, что экстракты дрожжей Saccharomyces cerevisiae по настоящему изобретению индуцируют быструю экспрессию иРНК противовоспалительного цитокина (IL-10).

Результаты, приведенные на фиг.12, представляют собой значения экспрессии иРНК через час (индекс A) и через 3 часа (индекс B) после приведения в контакт дрожжей или их производных с эпителиальными клетками кишечника, экспрессирующими ген, кодирующий нуклеарный рецептор PPARα.

На фиг.12 цифрами обозначены испытанные дрожжи/производные дрожжей, которые показали уровень медленной экспрессии, превышающий 3-кратный сравнительный сигнал:

1 означает дрожжи Saccharomyces cerevisiae ScPro1 по настоящему изобретению в сухой активной форме;

4 означает дрожжи Saccharomyces cerevisiae;

5 означает дрожжи Saccharomyces cerevisiae ScPro1 по настоящему изобретению в сухой активной форме;

8 означает фракцию клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae;

9 означает фракцию париетальных β-глюканов дрожжей Saccharomyces cerevisiae;

10 означает фракцию париетальных маннопротеинов дрожжей Saccharomyces cerevisiae;

11 означает фракцию ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae;

12 означает фракцию РНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Данные результаты хорошо демонстрируют, что дрожжи и производные дрожжей Saccharomyces cerevisiae по настоящему изобретению индуцируют медленную экспрессию, через три часа, гена, кодирующего нуклеарный рецептор PPARα.

Действительно, экспрессия иРНК в случае дрожжей и их производных по настоящему изобретению превышает 3-кратное значение по оси ординат, которое уже соответствует превосходному уровню медленной экспрессии.

ПРИМЕР 8. Исследование ex vivo регуляторной роли дрожжей и производных дрожжей в экспрессии генов, кодирующих IL-10 и TNF-α, в эпителиальных клетках кишечника человека выделенных из биопсийных материалов больных, страдающих болезнью Крона

Влияние дрожжей и/или производных дрожжей на секрецию цитокинов IL-10 (противовоспалительного) и TNF-α (провоспалительного) было исследовано ex vivo на биопсийных материалах больных, страдающих или не страдающих болезнью Крона.

Биопсийные материалы кишечника отбирали у больных, страдавших или не страдавших болезнью Крона, затем помещали на 24 ч в среду HBSS-CMF, дополненную пенициллином и стрептомицином, при 37°C в атмосфере, содержавшей 5% CO₂. После промывки биопсийные материалы приводили в контакт с дрожжами или производными дрожжей в течение 4 часов в среде RPMI 1640. Надосадочную жидкость отделяли для анализа способом ELISA. Затем биопсийные материалы подвергали лизису с целью экстракции как иРНК, так и общего белка.

Подтверждение секреции цитокинов осуществляли иммунологическим анализом надосадочных жидкостей культур клеток и белковых экстрактов способом ELISA. Белки денатурировали в течение 5 минут при 95°C в осадительном буферном растворе (об./об.; 75 мМ Tris, pH = 6,8; 5% глицерина; 0,25% бромфенолового синего; 2% SDS, 5% β-меркаптоэтанола), наносили (50 мкг) и разделяли на 10%-м геле полиакриламида. После разделения белки переносили на мембрану PVDF (Hybond-P, Amersham Pharmacia Biotech, Орсе, Франция) способом полусухого электропереноса (Hoefer TE77, Amersham Pharmacia Biotech, Орсе, Франция) в течение 1 часа при 16 В. PPARα и IL-10 выделяли с использованием поликлональных антисывороток кролика, анти-PPARα человека и анти-IL-10 человека, разбавленных в соотношении 1/500, и количественно определяли по хемилюминесценции (E.C.L. Amersham Pharmacia Biotech, Орсе, Франция) на пленке Biomax-MR (Kodak) посредством программы Gel Analyst (CLARA VISION, Париж, Франция).

На фиг.16 и 17 показаны результаты, полученные для IL-10 и TNF-α соответственно. По оси ординат отложено количество цитокинов, измеренное в пг/мл. Каждая точка соответствует результату измерения, полученному с биопсийным материалом больного, страдающего болезнью Крона в стадии обострения (кружок черного цвета), больного, страдающего болезнью Крона в стадии ремиссии (кружок серого цвета), и здоровых людей (кружок белого цвета). Прямоугольник соответствует среднему значению измерений.

— 1 означает дрожжи Saccharomyces cerevisiae ScPro1 по настоящему изобретению в сухой активной форме;

— 3 означает дрожжи Saccharomyces cerevisiae;

— 8 означает фракцию клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae;

— 11 означает фракцию ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae;

— 12 означает фракцию РНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

На фиг.16 показано, что дрожжи ScPro1 по настоящему изобретению увеличивают в 2 раза секрецию противовоспалительного цитокина IL-10 эпителиальными клетками больных, страдающих болезнью Крона или находящихся в стадии ремиссии, по сравнению со здоровыми людьми и негативной контрольной пробой (-), соответствующей измерениям, выполненным в присутствии только физиологического раствора.

На фиг.17 показано, что дрожжи ScPro1 по настоящему изобретению не вызывают увеличение секреции провоспалительного цитокина TNF-α кишечными клетками, выделенными из биопсийных материалов больных, страдающих болезнью Крона или находящихся в стадии ремиссии. Ни дрожжи ScPro1, ни какие-либо другие испытуемые дрожжи или производные дрожжей не индуцируют какую-либо секрецию TNF-α.

ПРИМЕР 9. Исследование аналгетических свойств дрожжей и производных дрожжей в модели с крысами при колоректальном расширении

Опыт со здоровыми крысами

1/ Материалы и методы

В данном исследовании были использованы крысы-самцы линии Sprague Dawley (Charles River, Арбресль, Франция) с массой тела в интервале от 175 до 200 г. Крысы проходили акклиматизацию в условиях питомника в течение недели перед экспериментом. Животных содержали по пять особей в клетке со свободным доступом к воде и пище. Все испытания проводили согласно рекомендациям Committee for Research and Ethical Issues, входящего в International Association for the Study of Pain [6]. Для избежания или минимизации дискомфорта животных были предприняты меры предосторожности.

2/ Оценивание чувствительности толстой кишки

Болевую рецепцию животных оценивали, измеряя давление внутри толстой кишки, необходимое для вызывания поведенческого ответа. Такое давление создавали колоректальным расширением посредством раздувания баллона, введенного в толстую кишку. Поведенческий ответ характеризуется поднятием задней части тела животного и ясно наблюдаемым абдоминальным сокращением, соответствующим сильным сокращениям 7. Крыс анестезировали летучим обезболивающим средством (2%-й изофлюран) и интраректально вводили баллон (методика согласно процедуре, описанной Bourdu [8]) как можно менее травматично на глубину 7 см от ануса. Катетер прикрепляли к основанию хвоста липкой лентой. Через 5 минут крыс помещали в середине коробки из плексигласа, и катетер присоединяли к электронному баростату (Distender Series IIRTM, G & J Electronics). Давление повышали непрерывно до отключения по болевому рефлексу или до достижения предельного значения давления, равного 80 мм рт. ст.

3/ Вводимые соединения

Дрожжи вводили через желудочный зонд один раз в день в течение 15 дней.

Для позитивного контроля за 30 мин до колоректального расширения внутрибрюшинно вводили морфий с дозой 1 мг/кг.

В исследовании использовали 8 групп крыс:

— 10 контрольных крыс, получавших PBS;

— 10 крыс, получавших ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме (100 мкг/день), (группа 1);

— 10 крыс, получавших ScPro1 в сухой форме (100 мкг/день), (группа 2);

— 10 крыс, получавших штамм SCB1 (100 мкг/день), (группа 3);

— 10 крыс, получавших штаммы ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме (50 мкг/день) + SCB1 в сухой быстрорастворимой форме (50 мкг/день), (группа 4);

— 10 крыс, получавших 1 инъекцию морфия (1 мг/кг, за 30 мин до расширения) (группа 5).

На фиг.26 показано, что дрожжи ScPro1, с одной стороны, введенные в сухой быстрорастворимой форме отдельно (группа 1) или в комбинации со штаммом SCB1 (группа 4), а с другой стороны, введенные в сухой активной форме (группа 2), увеличивают порог восприятия боли, значительно уменьшая, таким образом, восприятие висцеральной боли по сравнению с крысами, которым ничего не вводили.

Приведенные далее результаты даны в мм рт. ст. по сравнению с контрольной группой:

— 72 ± 2,59 против 53,6 ± 3,9, p 7 до 6·10 10 КОЕ и предпочтительно от 10 8 до 2·10 10 КОЕ дрожжей штамма по п.1 и/или дрожжей штамма по п.2.

7. Композиция по любому из пп.3-5, отличающаяся тем, что она содержит от 1 мг до 10 г и предпочтительно от 1 мг до 1 г дрожжей штамма по п.1 и/или дрожжей штамма по п.2 и/или по меньшей мере одного из париетальных маннопротеинов EL 05 и EL 06 дрожжей штамма по п.1.

8. Композиция по любому из пп.3-7 для использования при производстве пищевых композиций, предназначенных для улучшения комфортного состояния желудочно-кишечного тракта и/или улучшения кишечной микрофлоры.

9. Композиция по любому из пп.3-7 для использования при производстве фармацевтических композиций, предназначенных для лечения и/или профилактики расстройств кишечника, функциональных нарушений кишечника или заболеваний желудочно-кишечного тракта.

10. Композиция по любому из пп.3-7, для использования при производстве фармацевтических композиций, предназначенных для лечения и/или для профилактики патологий или расстройств кишечника, сопровождаемых состоянием гипералгезии.

11. Композиция по любому из пп.8-10, обеспечивающая введение дрожжей в суточной дозе от 10 7 до 6·10 10 КОЕ и предпочтительно от 10 8 до 2·10 10 КОЕ.

12. Композиция по любому из пп.8-10, обеспечивающая введение дрожжей и/или по меньшей мере одного из париетальных маннопротеинов EL 05 и EL 06 дрожжей штамма по п.1 в суточной дозе от 1 мг до 10 г.

Источник