что такое идентификация в микробиологии

Идентификация микроорганизмов

Смотреть что такое «Идентификация микроорганизмов» в других словарях:

идентификация микроорганизмов — определение принадлежности микроорганизмов к определенному виду, роду и т. д., основанное на изучении комплекса их биологических признаков (морфология, биохимическая активность, антигенные свойства, патогенность для животных и др.) … Большой медицинский словарь

ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРОБОВ ( — от позднелат. identifico отождествляю), определение видовой или типовой принадлежности микроорганизма на основании изучения культурально морфологич., биохимич., серологич. и патогенных свойств. Культуральные свойства микроорганизмов определяют… … Ветеринарный энциклопедический словарь

идентификация микробов — (от позднелат. identifico — отождествляю), определение видовой или типовой принадлежности микроорганизма на основании изучения культурально морфологических, биохимических, серологических и патогенных свойств.Культуральные свойства… … Ветеринарный энциклопедический словарь

КУЛЬТУРА МИКРООРГАНИЗМОВ — культура микроорганизмов, популяция клеток микроорганизмов (бактерии, дрожжи, актиномицеты, плесневые грибы), выращенная в жидкой или на плотной питательных средах. Различают чистую и смешанную К. м. Если на питательной среде вырастают… … Ветеринарный энциклопедический словарь

ДНК-ИДЕНТИФИКАЦИЯ — или типирование ДНК, установление генетической индивидуальности любого организма на основе анализа особенностей его дезоксирибонуклеинововой кислоты (ДНК). Получаемый при типировании профиль ДНК, как и отпечатки пальцев, может использоваться для… … Энциклопедия Кольера

вид — основная таксономическая единица, совокупность особей одного генотипа, обладающих хорошо выраженным фенотипическим сходством. Строгое общепринятое определение В. до сих пор не разработано. (Источник: «Микробиология: словарь терминов», Фирсов Н.Н … Словарь микробиологии

Череп — I Череп (cranium) скелет головы, состоящий из мозгового и лицевого (висцерального) отделов. В мозговом отделе выделяют крышу, или свод, и основание черепа. Мозговой отдел образует вместилища для головного мозга, органов обоняния, зрения,… … Медицинская энциклопедия

1: — Терминология 1: : dw Номер дня недели. «1» соответствует понедельнику Определения термина из разных документов: dw DUT Разность между московским и всемирным координированным временем, выраженная целым количеством часов Определения термина из… … Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации

Микробиологи́ческая диагно́стика — основана на идентификации возбудителя или выявлении иммунного ответа организма больного на него. Начальным этапом М.д. является отбор материала и транспортировка проб в лабораторию. Вид материала для исследования определяется особенностями… … Медицинская энциклопедия

Медицина — I Медицина Медицина система научных знаний и практической деятельности, целями которой являются укрепление и сохранение здоровья, продление жизни людей, предупреждение и лечение болезней человека. Для выполнения этих задач М. изучает строение и… … Медицинская энциклопедия

Блохина, Ирина Николаевна — В Википедии есть статьи о других людях с такой фамилией, см. Блохина. В Википедии есть статьи о других людях с именем Блохина, Ирина. Блохина Ирина Николаевна Дата рождения: 21 апреля 1921(1921 04 21) Дата смерти … Википедия

Источник

Сложности идентификации бактерий в современной микробиологии

Изучение микроорганизмов невозможно без распознавания принадлежности отдельных их колоний к тем или иным биологическим видам, типам, родам и т.д. Процесс аутентификации организмов является одним из самых важных и трудоемких этапов проведения биологических исследований. В бактериологии (раздел микробиологии) эта процедура носит название идентификация бактерий.

Методы проведения исследований по распознаванию микробов

Метод познания того или иного предмета представляет собой комплекс мер по решению определенной задачи. Методы идентификации различных микроорганизмов разрабатывались микробиологами и бактериологами на протяжении многих лет, и сегодня эти методы активно используются в науке, медицине, фармацевтике и даже в промышленном производстве (в том числе и продуктов питания). Основными методами распознавания бактерий являются:

Перечисленные методы представляют собой основу для исследователей и являются базисом для большого количества методик, которые позволяют определять такие свойства бактерий, как:

Установление специфических свойств дает возможность исследователю составить максимально полное представление о выделенной культуре бактерий.

Стадии идентификации

Несмотря на вековую историю изучения микроорганизмов, микробиология и сегодня испытывает сложности в изучении бактерий. Причина тому – микроскопические размеры самих организмов и продуктов их жизнедеятельности. Трудности присутствуют на всех стадиях. Всего основных стадий пять:

Порядок реализации каждой стадии зависит от того, идентификация на какие бактерии должна быть выполнена исследователем (аэробные, неферментирующие, грамотрицательные и т.д.).

Выделение чистой культуры

Идентификация любых бактерий невозможна без выделения чистой культуры. Это требование в микробиологии связано с тем, что присутствие микробов других родов и семейств во время проведения бактериологических исследований всегда существенно искажает результаты, вследствие чего исследователь производит неверные заключения. Для выделения чистой культуры используются различные методы, большинство из которых основано на бактериальных чашечных посевах:

Так, например, для выделения чистой аэробной (кислородозависимой) культуры практикуется следующая методика:

Полученные образцы с аэробными сообществами могут изучаться в свете идентификации на бактерии определенных родов.

Проверка по Граму

Практически при каждом бактериологическом исследовании в микробиологии бактериолог проводит проверку культуры по Граму (так называемое окрашивание по Граму). Это исследование дает возможность выявить наличие в образце грамотрицательных микроорганизмов. Грамотрицательные бактерии имеют особым образом устроенную клеточную стенку, которая состоит из нескольких белковых слоев (белок муреин). Вследствие такого устройства клеточной стенки, в грамотрицательных бактериальных клетках транспорт веществ внутрь клетки и за ее пределы имеет свои специфические черты. Это обстоятельство является важным при изучении биохимической активности грамотрицательных микроорганизмов. Без изначального определения особенностей строения клеточной стенки невозможно правильно подобрать питательную среду для дальнейшего культивирования и изучения грамотрицательных бактерий.

Идентификация по ферментативной активности

В результате изучения ферментативной активности бактерии (синтез определенных ферментов) исследователи могут давать достоверные заключения о принадлежности микроорганизмов к тем или иным биологическим родам, семействам и даже видам. Ферментативная активность исследуется по пяти основным направлениям:

Интерпретация результатов проведенных исследований и тестов производится с соблюдением следующих трех принципов:

Эталонные штаммы чаще всего представлены на планшетах тест-систем, которые позволяют завершить идентификацию бактерий определенного рода по исследованным биохимическим признакам.

Идентификация неферментирующих аэробных грамотрицательных микроорганизмов

Для родов бактерий этого типа (НГОБ) разработаны специализированные тест-системы, позволяющие определить принадлежность микроорганизмов к определенным группам. Определяется присутствие НГОБ по биохимическому составу питательных сред, на которых выращивались исследуемые бактериальные колонии. Особенность неферментирующих микробов состоит в том, что они не разлагают молекулы глюкозы, а используют ее в качестве окислителя (гликолиз). К основным родам неферментирующих бактерий относятся аэробные Pseudomonas, аэробные Acinetobacter, аэробные Burkholderia, аэробные Stenotrophomonas. Идентификация на НГОБ позволяет определить наличие патогенных микроорганизмов в собранных образцах и вовремя предпринять меры по предотвращению распространения инфекции.

Серологическая идентификация

Этот вид распознавания микроорганизмов применяется для идентификации антигенов бактериальной культуры. Серологические исследования проводятся с использованием иммунной диагностической сыворотки, по которой изучаются иммунные реакции исследуемых микроорганизмов:

Реакция агглютинации заключается в констатации выпадения осадка (агглютината), который появляется в результате взаимодействия бактериальной клетки с определенными антителами. Серологическая реакция преципитации заключается в выявлении антигенов, вырабатываемых определенными микробами на антитела, с образованием характерного мелкозернистого осадка.

Опасность неидентифицированного многообразия

Колоссальное количество неидентифицированных микроорганизмов, которые постоянно окружают человека в быту, может нести потенциальную угрозу для здоровья и даже для жизни. Так, микробиологами было исследовано наличие представителей рода спорообразующих бактерий Bacillus в колбасных и мясных продуктах, которые реализуются с полок магазинов. Как выяснилось, патогенные Bacillus присутствуют во всех видах колбас и в обработанных мясных продуктах:

При этом не стоит упускать из виду, что спорообразующие аэробные Bacillus при возникновении благоприятных условий для роста и размножения являются самыми опасными возбудителями инфекционных заболеваний, а при неблагоприятных – образуют термоустойчивые споры и готовы ждать своего часа сколь угодно долго.

Работаю врачом ветеринарной медицины. Увлекаюсь бальными танцами, спортом и йогой. В приоритет ставлю личностное развитие и освоение духовных практик. Любимые темы: ветеринария, биология, строительство, ремонт, путешествия. Табу: юриспруденция, политика, IT-технологии и компьютерные игры.

Источник

Тема 3.2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ

Введение. Идентификация — определение (установление) ви­довой принадлежности микроба. В настоящее время общепри­нятый метод идентификации основан на изучении определен­ного набора наиболее важных фенотипических признаков ис­следуемого микроорганизма. Критерием для идентификации является наличие у микроба совокупности основных призна­ков, характерных для данного вида (таксонометрических при­знаков). Установление вида производится согласно междуна­родной таксономии бактерий (Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology).

К основным видовым признакам бактерий относятся:

• тинкториальные свойства — особенности окрашивания с помощью простых и сложных методов окраски;

• культуральные признаки — особенности роста микроба на питательных средах;

в биохимические признаки — наличие у бактерий фермен­тов, необходимых для синтеза или расщепления (фер­ментации) различных химических соединений.

В бактериологической практике чаще всего изучают сахаро-литические и протеолитические ферменты.

К дополнительным признакам, используемым при идентифи­кации, относятся:

• чувствительность к видоспецифическим бактериофагам (см. главу 5);

• видовая резистентность к определенным антимикробным препаратам (см. главу 8);

• для патогенных бактерий — продукция определенных факторов вирулентности (см. главу 9).

Тонкая внутривидовая идентификация до биовара (серова-ра, фаговара, ферментовара и т.д.) — титрование — основана на выявлении соответствующего маркера: антигена (серотипи-рование, см. главу 10), чувствительности к типовому бактери­офагу (фаготипирование, см. главу 5) и др.

В последние годы разработаны и начали применяться со­временные биохимические и молекулярно-биологические ме­тоды идентификации: хемоидентификация, анализ нуклеино­вых кислот: рестрикционный анализ, гибридизация, полиме-разная цепная реакция (ПЦР), риботипирование и др.

? План занятия

? Программа

1. Идентификация бактерий.

2. Изучение биохимических свойств аэробных и ана­эробных бактерий.

? Демонстрация

1. Незасеянный «пестрый ряд».

2. Варианты изменения «пестрого ряда».

3. «Пестрый ряд» для анаэробных бактерий.

4. Микрометод изучения биохимических свойств бакте­рий.

5. Рост бактерий, вырабатывающих пигменты.

? Задание студентам

1. Зарисовать варианты изменения «пестрого ряда».

2. Оценить результаты отсева чистой культуры: отметить наличие или отсутствие роста посеянной культуры, а также присутствие посторонних бактерий.

3. Убедиться в чистоте выделенной культуры, для этого приготовить мазок и окрасить его по методу Грама.

4. Поставить каталазную пробу на стекле и оценить ее результат.

5. Учесть результаты определения биохимической актив­ности выделенных чистых культур.

6. С помощью таблицы-определителя на основании изу­ченных морфологических, тинкториальных, культу-ральных и ферментативных свойств идентифициро­вать выделенные микробы.

? Методические указания

Биохимическая идентификация.Для оценки биохимической активности бактерий используют следующие реакции:

1) ферментацию — неполное расщепление субстрата до промежуточных продуктов, например ферментацию угле­водов с образованием органических кислот;

2) окисление — полное расщепление органического суб­страта до С0₂ и Н2О;

3) ассимиляцию (утилизацию) — использование субстрата для роста в качестве источника углерода или азота;

4) диссимиляцию (деградацию) субстрата;

5) гидролиз субстрата.

Классический (традиционный) метод идентификации мик­робов по биохимическим признакам заключается в посеве чис­той культуры на дифференциально-диагностические среды, со­держащие определенные субстраты, с целью оценки способ­ности микроорганизма ассимилировать данный субстрат или определения конечных продуктов его метаболизма. Исследова­ние занимает не менее 1 сут. Примером является оценка саха-ролитической активности бактерий (способности ферментиро­вать углеводы) с помощью посева на среды Гисса — короткий и длинный «пестрый ряд».

Идентификация бактерий по биохимическим признакам с помощью сред «пестрого ряда». Корот­кий «пестрый ряд» включает жидкие среды Гисса с моно- и дисахаридами: глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и с 6-атомным спиртом — маннитом. В длинный «пестрый ряд» наряду с перечисленными углеводами вводят среды с разнооб­разными моносахаридами (арабиноза, ксилоза, рамноза, галак­тоза и др.) и спиртами (глицерин, дульцит, инозит и др.). Для оценки способности бактерий ферментировать углевод в среды добавляют индикатор (реактив Андреде или др.), позволяющий выявить образование кислых продуктов расщепления (органи­ческих кислот), и «поплавок» для обнаружения выделения со₂.

Чистую культуру исследуемого микроорганизма засевают пет­лей в среды «пестрого ряда». Посевы инкубируют при 37 «С в течение 18—24 ч или больше. В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, на­блюдается изменение цвета среды; при разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляется пузырек газа в поплавке. Если используют среды с полужидким агаром, то образование газа регистриру­ется по разрыву столбика. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Поскольку бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором называют «пестрым рядом» (рис. 3.2.1; на вклейке).

Для определения протеолитических ферментов производят посев культуры бактерий уколом в столбик 10—20 % желатина, пептонную воду. Посевы в желатине инкубируют при 20—22 °С в течение нескольких дней. При наличии протеолитических ферментов бактерии разжижают желатин, образуя фигуру, на­поминающую воронку или елочку.

В посевах в пептонную воду*определяют продукты расщеп­ления аминокислот после инкубирования в течение 2—3 сут при 37 °С путем постановки реакций на аммиак, индол, серово­дород и др.

Реакция на аммиак. Узкую полоску лакмусовой бу­маги укрепляют под пробкой так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой. Посинение бумаги свидетельствует об образовании аммиака.

Реакция на индол. Способ Эрлиха: в пробирку с куль­турой бактерий прибавляют 2—3 мл эфира, содержимое энер­гично перемешивают и добавляют несколько капель реактива Эрлиха (спиртовой раствор парадиметиламидобензальдегида с хлористоводородной кислотой). В присутствии индола наблю­дается розовое окрашивание, при осторожном наслаивании образуется розовое кольцо (см. рис. 3.2.1).

Реакция на сероводород. В пробирку с пептонной водой помещают узкую полоску фильтровальной бумаги, смоченную сульфатом железа, и закрепляют ее под пробкой так, чтобы она не соприкасалась с питательной средой. При выделении серо­водорода образуется нерастворимый сульфид железа (FeS), ок­рашивающий бумагу в черный цвет (см. рис. 3.2.1). Продукцию H₂S можно определять также путем посева культуры бактерий уколом в столбик с питательной средой, содержащей реактивы для выявления H₂S (смесь солей: сульфат железа, тиосульфат натрия, сульфит натрия). Положительный результат — среда приобретает черный цвет за счет образования FeS.

Обнаружение каталазы. На предметное стекло нано­сят каплю 1—3 % раствора пероксида водорода и вносят в нее петлю с бактериальной культурой. Каталаза разлагает пероксид водорода на кислород и воду. Выделение пузырьков газа свидетельствует о наличии у данного вида бактерий ката­лазы.

В бактериологической практике иногда ограничиваются изучением сахаролитических и протеолитических признаков исследуемых бактерий, если этого достаточно для их иденти­фикации. При необходимости Исследуют другие признаки, на­пример способность к восстановлению нитратов, карбоксили-рованию аминокислот, образованию оксидазы, плазмокоагула-зы, фибринолизина и других ферментов.

Результаты работ по идентификации выделенной культуры протоколируют (табл. 3.2.1).

Биохимические тесты 2-го поколения, основанные на при­менении концентрированных субстратов и более чувствитель­ных методов обнаружения конечных продуктов реакции, позволяют выявлять ферменты, уже существующие в микробной клетке, и, таким образом, не требуют дополнительного выра­щивания бактерий в процессе исследования. Это позволяет существенно сократить сроки исследования (до 4 ч). Биохими­ческие тесты 3-го поколения основаны на применении суб­стратов, меченных хромогеном или флюорохромом. Такой комплекс не окрашен или не флюоресцирует. При разрушении меченого субстрата ферментом микроба освобождается метка, что проявляется окрашиванием или флюоресценцией. Такие тесты позволяют использовать единичную бактериальную ко­лонию, полученную при первичном посеве исследуемого ма­териала на плотную питательную среду, для полной биохими­ческой идентификации, т.е. сокращает процесс выделения чис­той культуры до двух этапов.

В лабораторной практике применяются готовые микро­тест-системы (МТС) для идентификации основных групп микроорганизмов — возбудителей заболеваний человека. В со­временных МТС учет результатов и их интерпретация осу­ществляются автоматически с помощью компьютерных сис­тем анализа.

Биохимические и молекулярно-генетические методы иденти­фикации.Хемоидентификация — идентификация по химичес­кому составу микробной клетки. В состав любого организма входят 4 основных класса биомолекул: нуклеиновые кислоты, белки, углеводы и липиды. Хемоидентификация основана в первую очередь на анализе состава микробных липидов, по­скольку среди биополимеров они характеризуются наиболь­шим разнообразием мономеров (у различных бактерий обна­ружены более 300 разных типов жирных кислот и их производных). Это позволяет различать микробы, принадлежащие к разным видам, по количественному и качественному со­ставу липидов (жирных кислот, эфиров, спиртов, хинонов и т.д.). Анализ химического состава микробных клеток осу­ществляется с помощью метода хроматографии. Наиболее широко используют метод газожидкостной хроматографии. Ведущей областью применения метода являются идентифи­кация анаэробных бактерий по составу жирных кислот с короткой углеродной цепью (9—20 атомов углерода), относя­щихся к основным продуктам метаболизма этих микроорганиз­мов, а также идентификация медленно растущих бактерий (микобактерий) и бактерий с низкой ферментативной актив­ностью.

Молекулярно-генетические методы идентификации. Они ос­нованы на анализе бактериальных ДНК.

1. Рестрикционный анализ. ДНК обрабатывают рестрикционными ферментами — специфическими эндонуклеазами, которые разрезают молекулу ДНК по определенным по­следовательностям нуклеотидов. Далее проводят анализ полу­ченных фрагментов, уникальных для каждого вида микроорга­низма. Метод также позволяет осуществлять внутривидовое типирование бактерий.

2. Гибридизация ДНК. Любой микроорганизм имеет в своем геноме определенные уникальные последовательности, которые могут быть использованы для его идентификации. Метод обнаружения таких участков ДНК основан на способ­ности комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот к гибридизации. Исследование проводят с помощью нуклеиновых зондов — однонитевых фрагментов ДНК, ком­плементарных уникальным участкам микробного генома и не­сущих метку (радионуклид, фермент или флюорохром). Вклю­чение метки обеспечивает высокую чувствительность метода. В зависимости от выбранного генетического фрагмента зонды могут быть родо-, видо- или типоспецифическими. Быстрота и высокая чувствительность метода гибридизации позволяют существенно сократить время исследования. Основной облас­тью применения является идентификация трудно культивиру­емых или медленно растущих микробов (например, представи­телей родов Mycobacterium, Neisseria, Campylobacter). Особо сле­дует выделить метод риботипирования — идентификации, осно­ванной на анализе генов, кодирующих рибосомальные РНК.

3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР позволяет обнаруживать уникальные последовательности ДНК, присутствующие в образце в очень малых количествах. Теоретически достаточно одной копии искомой последователь­ности. Метод ПЦР основан на амплификации (увеличении числа копий) искомого участка генома микроорганизма. С этой целью образец инкубируют в буферном растворе с двумя ко­роткими ДНК-олигомерами (праймерами), комплементарны­ми концам известного фрагмента генома, термостабильной ДНК-полимеразой и нуклеотидами. После гибридизации оли-гомеров с комплементарными участками ДНК они служат праймерами для полимеразы, которая копирует искомый фраг­мент. Образец многократно нагревают для разделения цепей двойной спирали ДНК и остужают для повторной гибридиза­ции праймеров с комплементарной матрицей. Каждая копия ДНК становится новой матрицей для синтеза новой копии. Процедуру повторяют 20—40 раз. При этом количество копий искомого фрагмента генома увеличивается по экспоненциаль­ному закону. Амплификация в миллионы раз занимает всего несколько часов.

МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ ГРИБОВ

Морфология плесневых грибов. Вегетативное тело плесневого гриба — гифа — имеет нитевидную форму. Толщина гиф обыч­но превышает 2 мкм, что позволяет отличить их от актиноми-цетов, толщина клеток которых не превышает 1 мкм. Длина гиф у свободно живущих видов может достигать нескольких метров. У высших грибов гифа разделена мембранными пере­городками — септами, у низших септы отсутствуют. Гифы в процессе развития ветвятся и образуют анастомозы, за счет чего формируется переплетенная структура — мицелий. Разли­чают субстратные гифы (мицелий), погруженные в питатель­ный субстрат, и воздушные, растущие над его поверхностью.

Рис.4.1. Типы роста (филаментации) дрожжеподобных грибов рода

Candida. а — mycotorula; б — mycotoruloides; в — Candida; г — mycocandida.

Тема 4.1. МОРФОЛОГИЯ И ФИЗИОЛОГИЯ ГРИБОВ

1. Биологические особенности грибов.

2. Принципы классификации грибов.

3. Способы культивирования грибов.

4. Выделение и идентификация грибов рода Candida. а Демонстрация

1. Мазки: чистая культура грибов рода Candida (окраска по методу Грама).

2. Морфологические признаки плесневых грибов. Препараты «раздавленная» капля из чистых культур гри­бов родов Penicillium, Aspergillus, Mucor.

3. Питательные среды для культивирования грибов.

4. Рост и типы филаментации дрожжеподобных грибов рода Candida на картофельном агаре.

5. Изучение биохимических признаков чистой культуры грибов рода Candida («пестрый ряд»).

1. Микроскопировать и зарисовать мазки, предложен­ные для демонстрации.

2. Ознакомиться с таблицами.

3. Описать характер роста грибов рода Candida на глю-козокартофельном агаре. Указать тип филаментации (по данным таблицы «Бластоспоры и филаментация дрожжеподобных грибов»).

4. Проанализировать «пестрый ряд» чистой культуры грибов рода Candida, сверяя полученные результаты с данными таблицы «Таксономические признаки дрож­жеподобных грибов рода Candida», и сделать заклю­чение о видовой принадлежности.

Морфологию грибов изучают в нативных и фиксированных препаратах. Для приготовления нативного препарата «раздав­ленная капля» для изучения морфологии плесневых грибов отделяют препаровальными иглами небольшой участок мице­лия с плодоносящими гифами и прилегающим к нему тонким слоем питательной среды. Материал помещают в каплю воды на предметном стекле, иглой расправляют мицелий, придавли­вают покровным стеклом и микроскопируют при опущенном конденсоре. Препарат просматривают с объективом 8х, а затем — 40х. Предварительно колонии или культуры грибов микроскопируют непосредственно на чашках или в пробирках под малым увеличением.

Среда Сабуро состоит из дрожжевой воды с добавлением 1 % пептона, 2 % агара и 4 % мальтозы (или глюкозы). Питатель­ную среду разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 мин. В жидкие среды агар не добавляют.

ОБЛИГАТНЫЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПАРАЗИТЫ

Введение. К облигатным внутриклеточным паразитам отно­сятся все вирусы и некоторые бактерии (представители поряд­ков Chlamydiales и Rickettsiales), а также ряд видов патогенных простейших (Toxoplasma, Plasmodium и др.). Вирусы выделены в самостоятельное царство Vira. Вирусы не имеют клеточного строения, собственного метаболизма, содержат один тип нук­леиновой кислоты — ДНК или РНК, не размножаются бинар­ным делением и могут кристаллизоваться как неорганические вещества. Они являются облигатными внутриклеточными па­разитами с дизъюнктивным (разобщенным) типом размноже­ния. Внеклеточная форма существования вируса называется вирионом. В отличие от организмов, имеющих клеточное строе­ние, вирусы занимают промежуточное положение между живой и неживой материей. В основе классификации вирусов лежат определенные признаки:

1) тип вирусной нуклеиновой кислоты — ДНК-содержащие и РНК-содержащие;

2) тип симметрии капсида — изометрический (кубический), спиральный или смешанный;

3) наличие или отсутствие суперкапсида — просто или сложно устроенные;

4) тип хозяина — вирусы человека и животных, растений,

Тема 5.1. МОРФОЛОГИЯ И СТРУКТУРА ВИРУСОВ. ВИРУСОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Введение. Вирион состоит из сердцевины (нуклеиновой кис­лоты в комплексе с сердцевинными белками) и оболочек. Размеры вирионов колеблются от 15—20 (0,015—0,002 мкм) до 300-500 нм (0,3-0,5 мкм).

Существуют простые и сложные вирионы. Первые снабже­ны только капсидом. Форма просто устроенных вирусов опре­деляется типом симметрии его капсида: изометрическим или спиральным. У вирусов с изометрическим типом симметрии капсида отдельные морфологические субъединицы капсида (капсомеры) уложены на осях симметрии многогранника, на­пример икосаэдра (двадцатигранника). При этом вирион при­обретает сферическую форму. У вирусов со спиральным типом симметрии капсомеры уложены по спирали вокруг нуклеино­вой кислоты. При этом вирион приобретает палочковидную форму.

Сложные вирионы имеют дополнительную внешнюю обо­лочку — суперкапсид, покрывающий капсид снаружи. Супер-капсид представляет собой модифицированную мембрану клет­ки хозяина [цитоплазматическую (ЦПМ), ядерную или др.], содержащую вирусные белки и гликопротеины. Форма слож­ных вирусов обычно близка к сферической, для них характерен плеоморфизм.

Вирусы бактерий (бактериофаги) имеют сперматозоидную или нитевидную форму. Бактериофаги сперматозоидной фор­мы состоят из головки, в которой содержится нуклеиновая кислота, и отростка. Капсид головки фагов построен по изо­метрическому типу симметрии, а отростка — по спиральному. У некоторых фагов отросток очень короткий или может отсут­ствовать.

Морфологию вирусов изучают с помощью электронной микроскопии. Методы сканирующей электронной микроско­пии позволяют исследовать форму и характер поверхности вирусной частицы. Для изучения ультраструктуры вирусов применяют методы просвечивающей электронной микроско­пии.

Тема 5.2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ВИРУСОВ И ДРУГИХ ОБЛИГАТНЫХ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПАРАЗИТОВ (РИККЕТСИЙ, ХЛАМИДИЙ)

Введение. Вирусы не имеют собственного метаболизма. Для репродукции они используют метаболические системы клетки-хозяина.

Различают 3 типа взаимодействия вируса с клеткой.

1. Продуктивная инфекция. При этой форме инфек­ции в клетке происходит репродукция вируса и образуется вирусное потомство — 10 4 —10 б вирусных частиц, которые вы­ходят из зараженной клетки во внешнюю среду.

2. Интегративная инфекция. Геном вируса встраива­ется (интегрирует) в геном клетки-хозяина. Интегрированные вирусные геномы — провирусы — передаются потомству зара­женной клетки при делении. РНК-содержащие вирусы также могут вызвать интегративную инфекцию путем обратной транскрипции с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). При этом в клеточный геном встра­ивается образующаяся ДНК-копия вирусной РНК. При опре­деленных условиях интегративная форма вирусной инфекции может переходить в продуктивную.

3. Абортивная инфекция. При проникновении в клетку дефектного вируса, не способного к самостоятельной репро­дукции, или при попадании полноценного вируса в непермис-сивную (не подходящую для его репродукции) клетку, или при неподходящих условиях внешней среды возникает абортивная форма инфекции. Взаимодействие с клеткой прерывается на одной из ранних стадий — вирус не репродуцируется и не передается потомству зараженной клетки.

1. Методы культивирования вирусов, риккетсий, хламидий.

2. Методы индикации вирусов.

3. Бактериофаги: морфология и физиология, практичес­кое применение.

1. Питательные среды, растворы и лабораторная посуда для культур клеток.

2. Культуры клеток: незараженные, зараженные вирусом простого герпеса и хламидиями. Отметить изменения в культурах клеток, зарисовать, сделать вывод.

1. Учесть результаты реакции гемагглютинации (РГА), поставленной для выявления гемагглютинирующего вируса в материале из куриного эмбриона, и опреде­лить титр вируса.

2. Учесть результаты индикации вируса в культуре кле­ток по цветной пробе.

3. Учесть результат титрования бактериофага по методу Грациа.

4. Определить спектр литического действия бактерио­фага.

5. Ознакомиться с методом фаготипирования бактери­альных культур. Определить фаговары культур стафи­лококков, выделенных от больных.

6. Ознакомиться с препаратами бактериофагов, класси­фицировать по назначению.

Методы культивирования вирусов. Для культивирования ви­русов используют культуры клеток, куриные эмбрионы и чув­ствительных лабораторных животных. Эти же методы приме­няют и для культивирования риккетсий и хламидий — обли-гатных внутриклеточных бактерий, которые не растут на ис­кусственных питательных средах.

Культуры клеток. Представляют собой соматические или эмбриональные клетки животных или человека, культиви­руемые в лабораторных условиях. Клеточные культуры разли­чаются по источнику получения, способности к размножению in vitro и кариотипу. Их подразделяют на первичные (непере-виваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.

Первичные культуры клеток получают непосредственно из тканей многоклеточных организмов. Такие клетки обычно не способны к делению (неперевиваемые) и используются одно­кратно.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клет­ки различных тканей и органов, способные к ограниченному размножению in vitro. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 20—50 пассажей (пересе­вов) — до года — диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки при культивировании не претерпевают злокачественного пере­рождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.

Перевиваемые культуры клеток готовят из злокачественных линий клеток, обладающих способностью неограниченно раз­множаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся, например, злокачественные клетки HeLa, первоначально вы­деленные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы) и др.

Для выращивания клеточных культур используют питатель­ные среды сложного состава, включающие источники энергии, минеральные вещества, аминокислоты, витамины и другие факторы роста. Клетки чрезвычайно чувствительны к измене­нию рН среды. Для контроля рН в среды добавляют индикатор. Большинство клеточных культур растет в виде монослоя (плас­та, состоящего из одного слоя клеток), прочно прикрепляясь к поверхности контейнера для культивирования — пробирки, пластикового планшета или матраса (флакон 4-гранной фор­мы). Некоторые типы клеток способны расти также в суспен­зии.

Приготовление первичной культуры клеток включает не­сколько последовательных этапов: измельчение ткани, разъ­единение клеток путем трипсинизации, отмывание полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост (например, в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови). При оседании клетки довольно прочно прикрепляются к стенке пробирки или флакона, по которой распространяются в виде монослоя. После получения монослоя жизнеспособной культуры клеток ее заражают мате­риалом, содержащим риккетсии, хламидии или вирусы. Упо­мянутые микробы проникают внутрь клеток, где и размножа­ются. В культурах клеток удается культивировать большинство вирусов, вызывающих заболевания человека.

Внутриклеточные паразиты оказывают цитопатическое дей­ствие (ЦПД) на клетки, в которых происходит их репродукция. ЦПД может проявляться деструкцией (лизисом) зараженных клеток, изменением их морфологии (изменением размеров и формы самой клетки, клеточного ядра, появлением вакуолей или включений, представляющих собой внутриклеточные скопления вирусов, образованием синцития) и нарушением их функций.

Куриные эмбрионы. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминиро-ваны вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнитель­но высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям. Они пригодны для культивирования хламидии, риккетсии и некоторых вирусов, патогенных для человека.

Для получения чистых культур риккетсии, хламидии и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) исполь­зуют 8—12-дневные куриные эмбрионы. К недостаткам данно­го метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие большого количества белков и других соедине­ний, затрудняющих последующую очистку возбудителя при изготовлении различных препаратов.

Для заражения куриных эмбрионов исследуемый материал вводят в аллантоисную и амниотическую полости, на хорион-аллантоисную оболочку или в желточный мешок куриного

Рис.5.2.1. Способы заражения куриного эмбриона. 1 — в амниотическую полость; 2 — в аллантоисную полость; 3 — в желточный мешок.

эмбриона (рис. 5.2.1). Для заражения в аллантоисную полость в скорлупе над воздушной камерой (границы ее заранее обво­дят карандашом при просвечивании яйца) проделывают не­большое отверстие с помощью ножниц, скальпеля или специ­ального буравчика. Шприцем вводят 0,1—0,2 мл вируссодер-жащего материала на глубину 2—3 мм ниже границы воздуш­ной камеры. Отверстие в скорлупе заливают расплавленным парафином. Вскрытие зараженных эмбрионов производят в сроки максимального накопления вируса (через 48—72 ч ин­кубации при 37 °С). После обработки спиртом и 2 % раствором йода скорлупу рассекают ножницами немного выше очерчен­ной карандашом границы воздушной камеры, наклоняя яйцо так, чтобы избежать попадания скорлупы в полость. Скорлупу отбрасывают, осторожно снимают ее оболочку и рассматрива­ют хорион-аллантоисную оболочку вокруг места заражения, от­мечая наличие или отсутствие очагов поражения — геморрагии, бляшек и др. Затем пастеровской пипеткой прокалывают хори­он-аллантоисную оболочку в участке, свободном от сосудов, и отсасывают аллантоисную жидкость. После этого извлекают хо­рион-аллантоисную оболочку, дважды промывают ее изотони­ческим раствором хлорида натрия, помещают в чашку Петри и отмечают на черном фоне наличие специфических поражений. Лабораторные животные. Видовая чувствительность животных, их возраст определяют репродуктивную способ­ность вирусов. Во многих случаях только новорожденные жи­вотные чувствительны к тому или иному вирусу (например, мыши-сосунки к вирусам Коксаки). Преимущество метода культивирования облигатных внутриклеточных паразитов в ор­ганизме лабораторных животных перед другими состоит в воз­можности выделения тех вирусов, которые плохо репродуци­руются в культуре клеток или эмбрионе. К его недостаткам относятся высокая вероятность контаминации организма по­допытных животных посторонними вирусами и микоплазмами, а также необходимость последующего заражения культуры кле­ток для получения чистой культуры данного вируса, что уве­личивает сроки исследования.

Методы индикации вирусов. Для демонстрации при­сутствия вируса в клеточной культуре используют несколько методов.

I. О размножении (репродукции) вирусов в культуре клеток судят по цитопатическому действию (ЦПД), которое может быть обнаружено микроскопически по морфологическим из­менениям клеток. Часть таких клеток погибает и отслаивается от стенок пробирки. Вирусные частицы, освобождающиеся при разрушении одних клеток, инфицируют другие, которые через некоторое время также погибают. В результате вместо сплош­ного клеточного монослоя остаются лишь отдельные клеточ­ные островки. Характер ЦПД, вызванного разными вирусами, неодинаков. При репродукции одних вирусов (парамиксовиру-сы, герпесвирусы) наблюдается слияние клеток с образованием синцития, других (энтеровирусы, реовирусы) — сморщивание и деструкция клеток, третьих (аденовирусы) — агрегация кле­ток (рис. 5.2.2) и т.д. ЦПД вирусов оценивают в динамике, просматривая культуру клеток под микроскопом в разные сроки после ее заражения вируссодержащим материалом. Не­которые вирусы (энтеровирусы, герпесвирусы) вызывают ЦПД в течение 1—2 сут, другие — в более поздние сроки (на 4—6-й день). Характер ЦПД используют как для обнаружения вирусов (индикации), так и ориентировочной идентификации, т.е. оп­ределения их видовой принадлежности.

Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по включениям, которые они образуют в ядре или цитоплазме зараженных клеток. Форма включений различна, а размеры колеблются от 0,25 до 25 мкм. Они представляют собой места скопления вирусных частиц и могут быть выявлены в препара­тах, приготовленных из зараженной ткани и окрашенных по методу Романовского—Гимзы или флюорохромами. В послед­нем случае используют люминесцентную микроскопию.

В клетках, пораженных риккетсиями, на 3—8-й день отме­чается большое количество коккобациллярных форм, целиком заполняющих цитоплазму или ядро клеток, которые затем гиб­нут. Хламидии также рассматривают в окрашенных по методу Романовского—Гимзы препаратах клеток, в которых образуют­ся цитоплазматические включения, представляющие собой внутриклеточные микроколонии этих бактерий.

Рис. 5.2.2. Культура клеток, а — неизмененные клетки; б — цитопатические изменения в клетках.

Для исследования морфологии контаминированных клеток используют специальный инвертированный микроскоп, у ко­торого осветитель располагается сверху, а объективы — снизу от предметного столика. С помощью такого прибора можно оценивать морфологию клеток, растущих в виде монослоя на поверхности контейнера для культивирования. Морфологичес­кие изменения клеток выявляют при микроскопическом ис­следовании культуры с помощью объектива 8х или 40х. При сравнении клеточного монослоя, инфицированного вирусом, с незараженными клетками в контрольной пробе отмечают полное или островковое разрушение пласта клеток либо другие изменения, которые характеризуют ЦПД вируса. Для более детального изучения ЦПД в контейнер для культивирования помещают покровное стекло, на котором образуется монослой. В дальнейшем стекло извлекают, зараженные клетки фиксиру­ют и готовят микроскопический препарат, который окрашива­ют (по методу Романовского—Гимзы, флюорохромами и т.д.) и изучают иммерсионным методом.

ЦПД вирусов можно также продемонстрировать с помощью «цветной пробы»: метаболически активные клетки культуры в ходе жизнедеятельности выделяют кислые продукты, что вы­зывает изменение цвета индикатора, присутствующего в куль-туральной среде. При репродукции вируса клетки утрачивают способность к метаболизму и погибают, поэтому окраска среды с течением времени не меняется.

И. Реакцию гемадсорбции применяют для индикации гемаг-глютинирующих вирусов. Реакция основана на способности поверхности клеток, в которых репродуцируются такие вирусы, адсорбировать эритроциты. Для постановки реакции гемад­сорбции в культуру клеток, зараженных вирусами, добавляют взвесь эритроцитов и после некоторого времени контакта клет­ки промывают изотоническим раствором хлорида натрия. На поверхности пораженных вирусами клеток остаются прилип­шие эритроциты.

Для количественного обнаружения вирусных частиц ис­пользуют методы титрования. Титр вируса можно определить в реакции гемагглютинации с 10-кратными разведениями куль­туральной среды, или материала из куриного эмбриона, или по ЦПД в культуре клеток. В последнем случае клетки культуры заражают 10-кратными разведениями материала, содержащего вирус. После 6—7-дневной инкубации их просматривают на наличие ЦПД. За титр вируса принимают наибольшее раз­ведение, которое вызывает ЦПД в 50 % зараженных куль­тур. Титр вируса выражают количеством цитопатических (инфекционных) доз (ИД₅о). Более точным количествен­ным методом учета отдель­ных вирусных частиц являет­ся метод бляшек (рис. 5.2.3). Культуру клеток заражают вирусом и покрывают тон­ким слоем агара. После ин­кубирования посевов в тече­ние нескольких суток на по­верхности агара появляются просветленные участки опре­деленной формы (бляшки), представляющие собой участ­ки погибших клеток в сплош­ном монослое культуры кле­ток. Каждая бляшка образуется при размножении одной ви­русной частицы и хорошо заметна в виде круглого светлого участка на красном фоне клеток, прижизненно окрашенных нейтральным красным. Титр вируса, установленный этим ме­тодом, выражают числом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл. Размеры, морфология и сроки появления бляшек разли­чаются не только у разных видов вирусов, но и у отдельных штаммов одного и того же вида. Перечисленные признаки используют для селекции штаммов и получения так называе­мых чистых линий вирусов.

Тема 5.3. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВИРУСОВ (ФАГОВ) И ИХ ИНДИКАЦИЯ

Введение. Вирусы бактерий, или бактериофаги (фаги), ши­роко распространены в окружающей среде — водоемах, почве. Фаги кишечных бактерий (кишечной палочки, шигелл, саль­монелл) могут быть выделены из сточных вод и испражнений. Фаги стафилококков обнаруживают в слизи из носоглотки, на коже и в раневом отделяемом, фаги клостридий, вызывающих анаэробную раневую инфекцию, — в раневом отделяемом, почве. Наличие фага в среде указывает на присутствие чувст­вительных к нему бактерий.

Существуют вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные фаги вызывают продуктивную инфекцию, заканчивающуюся образованием новых фаговых частиц и лизисом бактериальных клеток. Умеренные фаги вызывают интегративную инфекцию, не приводящую к лизису зараженных ими клеток. ДНК этих фагов включается в хромосому бактерий и передается при их делении неограниченному числу потомков. Такой тип взаимодействия фага с клеткой называют лизогенией, а бактерии, несущие в своей хромосоме фаговую ДНК (профаг), являются лизогенными. Под действием различных факторов в клетках лизогенных бактерий может происходить индукция профага — выщепление его ДНК из хромосомы бактерии и развитие продуктивной инфекции. Лизогенные фаги широко распространены в природе.

Рис.5.3.1. Негативные колонии (стерильные пятна) бактериофагов, а — пятна фага Т₂; б — пятна фага Tj.

Репродукция вирулентного фага в клетках бульонной бак­териальной культуры сопровождается лизисом бактерий и про­светлением среды. На газоне чувствительных бактерий, выра­щенных на плотной питательной среде в чашке Петри, фаги образуют зоны очагового или сплошного лизиса, что зависит от их концентрации. Зоны очагового лизиса получили название негативных колоний фага, или стерильных пятен — бляшек (рис. 5.3.1). Они имеют морфологию, характерную для определенных фагов, и образуются из одной фаговой частицы при ее внед­рении и последующей репродукции в бактериальных клетках. Каждая инфицированная фагом бактерия лизируется и осво­бождает потомство фага, состоящее из сотен новых фаговых частиц. Они внедряются в интактные клетки, и весь цикл повторяется. В результате лизиса клеток на сплошном бакте­риальном газоне появляются негативные колонии фага.

Для получения «чистой» линии фага (свободной от примеси других фагов) проводят последовательные пассажи морфоло­гически однотипных негативных колоний на газоне одного и того же бактериального штамма.

Большинство фагов характеризуется видоспецифичностью в отношении бактерий. Однако существуют фаги, которые могут поражать только отдельные варианты одного и того же вида бактерий. Их используют для определения фаготипов (фагова-ров) внутри данного вида. Вместе с тем имеются фаги, лизи-рующие родственные виды бактерий. В практической работе фаги применяют для:

1) фаготипирования бактерий, т.е. определения фаготипа по лизису штаммов бактерий одного и того же вида типоспеци-фическими фагами, что важно для маркировки исследуемых бактерий при эпидемиологическом анализе заболеваний;

2) фагоидентификации бактериальных культур с целью ус­тановления их видовой принадлежности;

3) фагодиагностики, заключающейся в выделении фага из организма больного (например, из испражнений), что косвен­но свидетельствует о наличии в материале соответствующих бактерий;

4) фагопрофилактики — предупреждения некоторых заболе­ваний (например, дизентерии) среди лиц, находящихся в эпи­демическом очаге;

5) фаготерапии — лечения некоторых инфекционных забо­леваний, вызванных, например, шигеллами, протеем, стафило­кокком.

? План

? Программа

1. Методы выделения фагов из объектов окружающей среды и их идентификация.

2. Метод титрования фага по Грациа.

3. Метод обнаружения лизогенных бактерий.

4. Метод фаготипирования бактерий.

? Демонстрация

1. Методы выделения фага из объектов окружающей среды.

2. Методика обнаружения лизогенных бактерий.

? Задание студентам

1. Учесть результат титрования бактериофага по методу Грациа.

2. Определить спектр литического действия бактериофа­га.

3. Ознакомиться с методом фаготипирования бактери­альных культур. Определить фаговары культур стафи­лококков, выделенных от больных.

4. Ознакомиться с препаратами бактериофагов, класси­фицировать по назначению.

? Методические указания

Выделение фага из объектов окружающей среды. Для полу­чения вирулентного фага готовят фильтрат, пропуская исходный материал (вода, суспензия фекалий и др.) через бактери­альные фильтры. Фильтрат вместе с соответствующей бактери­альной культурой засевают в бульон и инкубируют при 37 °С в течение 18—24 ч. После лизиса культуры оставшиеся бакте­риальные клетки удаляют центрифугированием или фильтра­цией через бактериальный фильтр. Наличие фага в фильтрате определяют качественными и количественными методами.

Качественный метод определения фагов E.coli. Чашку Петри с питательным агаром засевают суточной бульонной культурой кишечной палочки газоном и подсушивают при 37 °С в течение 10—15 мин. Затем на поверхность газона наносят каплю фага и наклоняют так, чтобы капля стекла к противоположному краю. После суточной инкубации в термостате просматривают чаш­ку, отмечая наличие зоны лизиса по месту отекания капли фага.

Таблица 5.3.1. Результаты титрования фага но методу Грациа (форма протокола)

Определение спектра литичес-кого действия фага. Чашку с пи­тательным агаром делят на квад­раты по числу испытуемых бак­териальных культур. На каждый квадрат петлей наносят каплю со­ответствующей бульонной куль­туры и распределяют ее по агару в пределах данного квадрата. За­тем на каждый засеянный квад­рат петлей или пастеровской пи­петкой наносят по одной капле испытуемого фага. После суточ­ной инкубации в термостате просматривают чашку, отмечая те квадраты, где имеется сплош­ной лизис бактерий или так на­зываемые стерильные пятна на бактериальном газоне. Количество различных бактериальных культур, которые лизируются испытуемым фагом, определяет широту спектра его литического действия.

Фаготипирование бактерий. Испытуемую суточную бульон­ную культуру бактерий засевают на поверхность питательного агара в чашке Петри, слегка подсушивают в термостате, затем делят на квадраты, на которые пастеровской пипеткой наносят по одной капле различных типоспецифических фагов. После суточной инкубации отмечают на чашке те квадраты, в кото­рых имеется сплошной лизис бактерий. Фаготип бактериаль­ной культуры определяется тем типом фага, который вызывает ее лизис (рис. 5.3.2).

Определение лизогении. Исследуемую суточную бульонную культуру центрифугируют для отделения фага от бактерий. В том случае, если бактерии спонтанно продуцируют фаг, последний будет содержаться в надосадочной жидкости. Для выявления фага надосадочную жидкость засевают на газон индикаторной (чувствительной) бактериальной культуры, на котором через 1 сут инкубации при 37 °С образуются очаги лизиса — «сте­рильные» пятна. При отрицательном результате опыта иссле­дуемую бактериальную культуру предварительно подвергают УФ-облучению с целью индукции содержащегося в ней про-фага. Затем поступают так же, как и в предыдущем опыте.

Источник