что такое горизонтальный перенос генов
Поверх барьеров
Что такое горизонтальный перенос генов и насколько он распространен
Авторы недавнего (и, по мнению специалистов, довольно плохого) обзора про ГМО-еду вспомнили старую страшилку, заключающуюся в том, что фрагменты ДНК из пищи, которую мы употребляем, могут попадать в клетки человека или населяющих его микроорганизмов и влиять на экспрессию генов хозяина или даже встраиваться в геном. Подобных примеров современная наука не знает, но вообще случаи горизонтального переноса генов — попадания в организм фрагментов ДНК не от родителей, а извне, из окружающей среды, ученым известны, и многие из них описаны довольно хорошо. Мы решили разобраться в этом вопросе.
Несмотря на то, что позвоночные животные едят ДНК-содержащую еду миллионы лет, свидетельств тому, что съеденные гены как-то влияют на собственный геном, ученые пока не нашли. Тем не менее, получить ДНК не от родителей, а откуда-то извне возможно — этот феномен называется горизонтальным переносом генов. С началом эры массового секвенирования геномов и биоинформатики стало понятно, что горизонтальный перенос сыграл значительную роль в эволюции как прокариот (бактерий и архей), так и высших эукариот, например, растений.
Тем не менее, заполучить чужую ДНК не так-то просто, а наличие и количество, к примеру, бактериальной ДНК в геноме человека до сих пор остается дискуссионным вопросом.
Без ядра
Для того чтобы в геноме появился новый элемент, необходимо, чтобы новая ДНК попала в клетку и встроилась в хромосому. Логично, что проще всего выполнить эти условия, если организм одноклеточный и у него нет дополнительной ядерной оболочки, защищающей геном. По всей видимости, прокариоты (бактерии и археи) действительно пользуются горизонтальным переносом очень активно — для них это еще и аналог полового процесса, позволяющий внести разнообразие в генетическую информацию, наряду со случайным мутагенезом.
Свидетельство того, что бактерии могут получать новые признаки прямо из среды, было найдено еще до прочтения первого генома и даже до открытия того факта, что ДНК является носителем информации. В 1928 году Фредерик Гриффит обнаружил, что неопасный штамм пневмонийного стрептококка после инкубации с останками убитого вирулентного штамма также приобретает способность заражать мышей. Позже стало понятно, что исследуемый штамм захватывал из среды ДНК вирулентного «родственника» в процессе натуральной трансформации.
В норме крупные молекулы ДНК не могут пройти через бактериальную клеточную стенку и мембрану, однако многие виды бактерий способны входить в так называемое состояние компетентности, когда под действием специальных белков молекулы «затаскиваются» внутрь клетки, предварительно связавшись с рецепторами ДНК. Клетки становятся компетентными только в особых условиях, связанных, например, с лимитированием ресурсов, которое происходит, когда культура достигает критической плотности, или при повреждении ДНК.
В лаборатории свойство компетентности используют для того, чтобы искусственно доставлять ДНК в бактериальные клетки, а в природе к развитию компетентности и натуральной трансформации способны как минимум несколько десятков видов бактерий, среди которых множество патогенных. Как в случае с опытами Гриффита, внешним источником ДНК могут быть погибшие клетки, кроме того, некоторые бактерии выделяют ее наружу намеренно, с использованием систем секреции.
Помимо трансформации, бактерии способны обмениваться ДНК путем конъюгации. Этот специализированный процесс передачи ДНК между клетками при непосредственном контакте был открыт на кишечной палочке в середине XX века. Для того чтобы передать ДНК, клетки кишечной палочки должны содержать небольшую кольцевую экстрахромосомную молекулу ДНК — плазмиду, которая содержит гены, необходимые для конъюгации, и которая, собственно, и передается.
Конъюгация осуществляется с образованием половых пилей — белковых трубочек, при помощи которых устанавливается физический контакт. Кроме кишечной палочки, процесс был найден и у множества других бактерий. Помимо генов, необходимых для собственного распространения, конъюгативная плазмида может содержать гены других полезных признаков, поддерживаемых отбором, например, устойчивости к антибиотикам.
Молекулярный механизм передачи F-плазмиды путем конъюгации у бактерий
Кроме самых известных трех перечисленных механизмов, в последнее время были открыты менее распространенные агенты генетического переноса (GTA — gene transfer agents), которые представляют собой белковые «посылки», содержащие небольшие случайные последовательности хозяйской ДНК. Кроме того, у архей был обнаружен процесс обмена генетической информацией путем слияния мембран двух клеток в нескольких местах и образования межклеточных мостиков.
Встроить в геном можно не любую ДНК — в общем случае полученный фрагмент просто разрушится внутриклеточными ферментами — нуклеазами и рестриктазами, которые защищают клетку от вторжения. Обмен генами происходит чаще между близкородственными штаммами, у которых большой процент похожих последовательностей. В таком случае новый фрагмент ДНК может встроиться в геном по механизму гомологичной рекомбинации, для которой необходимо наличие одинаковых или близких по составу нуклеотидных последовательностей.
В других случаях ДНК может передаваться в составе мобильных элементов и плазмид. Эти элементы представляют собой кусочки «эгоистичной ДНК», которая содержит последовательности, необходимые для собственного копирования и встраивания. Такие кусочки могут встраиваться в геном при помощи сайт-специфической рекомбинации, для которой необходима определенная, иногда очень короткая последовательность в геноме. Показано, что чем больше в бактериальном геноме мобильных элементов, тем больше событий горизонтального переноса было в ее истории.
В самых редких случаях ДНК может встроиться на хромосому «просто так», путем незаконной рекомбинации, однако этот процесс сопряжен с возникновением двуцепочечных разрывов, что опасно и нежелательно для клетки. Наконец, плазмиды и вирусы могут существовать в клетке и не встраиваясь в геном, а в виде отдельного экстрахромосомного элемента, как в случае с конъюгативными плазмидами. Мобильные элементы и плазмиды позволяют обеспечить горизонтальный перенос между отдаленными видами бактерий и даже между прокариотами и эукариотами.
Странные деревья
Если существование горизонтального переноса было установлено еще до расшифровки последовательностей генома, то масштабы явления стали понятны только с наступлением эры секвенирования. Попытки построить для всех живых организмов универсальное филогенетическое дерево на основании последовательностей геномов привели к ряду филогенетических конфликтов. Нередко какие-то гены обнаруживаются там, где по логике эволюционного наследования, их быть не должно. Отсутствие гена у предков организма часто наводит исследователей на мысль, что он получен путем горизонтального переноса.
Расшифровка множества эукариотических геномов позволила предположить, что горизонтальный перенос сыграл важную роль в эволюции не только бактерий, но и одноклеточных эукариот, в частности, простейших, а также водорослей и высших растений, многих беспозвоночных животных.
У прокариот механизмы доставки новых генов более или менее изучены и понятны, но у эукариот ДНК дополнительно защищена ядерной мембраной и белками-гистонами. Кроме того, если речь идет о многоклеточных организмах с половым размножением, то для того, чтобы закрепиться в поколениях, хромосома с новым элементом должна попасть в половые клетки. Таким образом, на пути горизонтального переноса у более сложных организмов, нежели бактерии, стоит множество барьеров. Поэтому в его наличие стоит верить только при существовании вероятного механизма передачи.
Биологам известны и современные примеры эндосимбиоза и эндопаразитизма, сопровождающиеся горизонтальным переносом генов. К примеру, внутриклеточный симбионт членистоногих и некоторых червей-нематод бактерия вольбахия нередко встраивает большие куски своего генома в геном хозяина. Вероятно, это происходит случайно в процессе репарации ДНК, и большой пользы хозяевам вольбахии от этого нет, так как большинство бактериальных генов при этом неактивны или превращаются в псевдогены, то есть необратимо ломаются.
Микрофотография вольбахии внутри клетки насекомого
Genome Sequence of the Intracellular Bacterium Wolbachia. PLoS Biol 2004
РНК-полимераза, горизонтальный перенос генов и связь поколений в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ИМГ РАН
РНК-полимераза, горизонтальный перенос генов и связь поколений в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ИМГ РАН
Автор
Редакторы
Транскрипция — это не только способ написать слова на разных языках, но и важнейшее событие в жизни генов: ведь именно благодаря транскрипции информация из ДНК переписывается в РНК, которая, в свою очередь, направляет синтез белков и выполняет множество других функций в клетке. Поэтому РНК-полимераза — молекулярная машина, осуществляющая транскрипцию, — любимый объект исследований молекулярных биологов. Понять, как работает РНК-полимераза, — значит в большой степени понять, как работают и регулируются гены, живут и взаимодействуют с окружающим миром клетки и целые организмы. Исследования РНК-полимеразы зачастую напоминают игру с молекулами, но их результаты не только помогают узнать, как устроен мир, но и служат основой для создания новых антибиотиков и других лекарств. В лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ИМГ РАН на площади Курчатова в Москве много лет занимаются фундаментальными исследованиями транскрипции и ее регуляции. И хотя уже сделано много захватывающих открытий, работа с каждым годом становится все интереснее.
Обратите внимание
Нельзя объять необъятное. В рубрике «Места» мы рассказываем только о внутренней жизни лабораторий и их научной работе. За кадром остаются внешние трудности и конфликты, конкуренция между лабами, сложные политические решения и всё такое прочее.
Андрей Кульбачинский
О механизмах транскрипции и исследованиях лаборатории рассказывает Андрей Кульбачинский, доктор биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной генетики микроорганизмов (ЛМГМ) Института молекулярной генетики РАН, профессор кафедры молекулярной биологии Биологического факультета МГУ, профессор РАН.
— Все известные нам формы жизни строго зависят от точности передачи генетической информации и ее реализации через синтез РНК и белков. Это нашло свое отражение в эволюционной консервативности аппарата, выполняющего такие функции. Процессы репликации и транскрипции относятся к матричным реакциям, в ходе которых новые молекулы ДНК или РНК копируются с исходной ДНК-матрицы на основании принципа комплементарности. Эти процессы происходят при участии специальных ферментов: ДНК- и РНК-полимераз. Благодаря различиям в строении и взаимодействиях с другими факторами, эти ферменты выполняют очень разные функции. Однако в основе работы любых ДНК- или РНК-полимераз лежит единый механизм катализа. Более того, структура РНК-полимераз оказалась очень похожей у всех клеточных организмов: РНК-полимераза кишечной палочки и наши с вами полимеразы являются прямыми эволюционными родственниками. Это позволяет понять общие механизмы транскрипции, исследуя избранные модельные организмы и системы.
В статье «Бактерии способны заменить утраченный белок всего за 96 часов» [1] рассказывается, как лишённые жгутиков бактерии Pseudomonas fluorescens с помощью мутаций всего за 4 дня выращивают себе новые. Самая настоящая эволюция в реальном времени! — Ред.
РНК-полимераза Thermus thermophilus — бактерии, живущей в горячих источниках на Камчатке.
фотография Л. Минахина, рисунок А. Кульбачинского
Наши исследования носят фундаментальный характер: ведь изучение механизмов транскрипции и горизонтального переноса генов приближает нас к пониманию того, как устроена живая природа. В то же время ярким прикладным аспектом изучения обоих процессов является понимание природы устойчивости бактерий к антибиотикам. Существует довольно обоснованное мнение, что человечество может вновь оказаться беззащитным перед бактериями вследствие неконтролируемого применения антибиотиков и роста числа суперустойчивых штаммов. Исследования горизонтального переноса генов проливают свет на механизмы такого быстрого распространения устойчивых бактерий. Некоторые антибиотики действуют именно на РНК-полимеразу бактерий, связываясь с ней в таких местах, которые сильно отличаются от РНК-полимераз эукариот. Мы исследуем взаимодействия известных антибиотиков с РНК-полимеразой и разрабатываем методы для поиска новых ингибиторов транскрипции. Сейчас работа идет весело и легко (по крайней мере, с точки зрения руководителя лаборатории): доступен весь арсенал методов молекулярной биологии, известно строение РНК-полимеразы, многих регуляторов транскрипции, мобильных генетических элементов, генов устойчивости к антибиотикам. Однако начиналось всё не так. На заре молекулярной биологии не было даже известно, есть ли в клетке РНК-полимераза, а доступные методы анализа транскрипции ограничивались измерением радиоактивности в сцинтилляционных счетчиках.
Немного истории
— Лаборатория возникла в середине 50-х годов благодаря выдающемуся отечественному ученому Роману Бениаминовичу Хесину — основоположнику молекулярной генетики в нашей стране. О Хесине более подробно можно прочитать во многих публикациях [2], [3], я скажу только, что учился он у выдающегося генетика Александра Сергеевича Серебровского, а после разгрома генетики в 1948 году стал биохимиком — это и позволило ему впервые объединить генетические и биохимические исследования в одной лаборатории. Р.Б. Хесину удалось привлечь к работе многих выпускников МГУ и Физтеха и создать замечательный коллектив талантливых и увлеченных наукой молодых людей. Попробую перечислить основных из них: О.Б. Астаурова, И.А. Басс, Е.С. Богданова, Ж.М. Горленко, О.Н. Данилевская, Ю.Н. Зограф, Т.С. Ильина, Э.С. Каляева, Б.A. Лейбович, В.Г. Никифоров, М.Ф. Шемякин. И конечно нельзя не вспомнить Ж.Г. Шмерлинг, разделившую с Р.Б. Хесиным все невзгоды и удачи многолетней совместной работы.
Именно под руководством Р.Б. Хесина уровень исследований в лаборатории вышел на передовые мировые позиции, а написанные им классические статьи 60–70-х годов до сих пор цитируются в обзорах и учебниках по молекулярной биологии [4–6]. Многое может рассказать Софья Захаровна Миндлин, которая принимала непосредственное участие в этих работах и внесла огромный вклад в исследования механизмов транскрипции, горизонтального переноса генов, устойчивости к антибиотикам. Софье Захаровне посчастливилось закончить кафедру генетики МГУ имени М.В. Ломоносова до августовской сессии ВАСХНИЛ 1948 года. Еще в 50-е годы Софья Захаровна совместно с Сосом Исааковичем Алиханяном выполнила цикл работ, посвященных генетике и селекции продуцентов антибиотиков, причем часть их была опубликована в Nature [7], [8]. В 1967 году Софья Захаровна перешла в лабораторию Хесина, чтобы соединить вместе генетику и биохимию в исследованиях транскрипции. И сегодня Софья Захаровна активно участвует в работе и служит примером для подражания для всех сотрудников лаборатории. Можно себе представить, с каким интересом мы слушаем ее рассказы о развитии генетики в нашей стране!
Роман Бениаминович Хесин
Вручение премии за лучшую фундаментальную работу в 1977 г. Слева направо: Ж.М. Горленко, О.Н. Данилевская, Р.Б. Хесин, С.З. Миндлин, И.А. Басс.
Софья Захаровна Миндлин — д.б.н., ведущий научный сотрудник ЛМГМ.
— Хотя о нашей истории можно говорить очень долго, и многие результаты вошли в книги и учебники, я постараюсь кратко суммировать основные достижения лаборатории Р.Б. Хесина в 1962–1984 гг.:
А.В. Кульбачинский и С.З. Миндлин
РНК-полимераза как молекулярный конструктор (современные исследования)
— Должен сказать, — продолжает свой рассказ Андрей Кульбачинский, — что две основные темы исследований Р.Б. Хесина — механизмы регуляции экспрессии генов и горизонтальный перенос генов у бактерий — оказались чуть ли не главными проблемами молекулярной генетики и не теряют актуальности и сегодня. Уже в последнее время произошли крупные открытия в области транскрипции: была расшифрована трехмерная структура РНК-полимеразы и ее комплексов с разными факторами и антибиотиками, открыты механизмы синтеза и редактирования РНК. Сейчас, имея «на руках» структурную и геномную информацию, мы можем сравнивать работу РНК-полимераз и связанных с ней факторов и выяснять тонкие механизмы регуляции генов у разных бактерий. Я перечислю несколько наиболее интересных проектов на эту тему:
Лучше всего об этих проектах могут рассказать сами участники работы.
Наталия Миропольская — к.б.н., старший научный сотрудник ЛМГМ. Наталия — автор статей в ведущих международных журналах (включая Molecular Cell, PNAS, NAR), в 2012 г. получила премию Европейской академии для молодых ученых, а в 2015 г. — национальную стипендию Лореаль-Юнеско «Для женщин в науке». Наталия исследует механизмы работы активного центра РНК-полимеразы, получает аптамеры к РНК-полимеразе и новые ингибиторы транскрипции.
Наталия Миропольская за работой по исследованию устройства активного центра РНК-полимеразы
— В ходе транскрипции РНК-полимераза последовательно присоединяет рибонуклеотиды к растущей цепи РНК, при этом длина транскрипта может достигать многих тысяч нуклеотидов. В отличие от ДНК-полимераз, РНК-полимераза не имеет права прекратить синтез, а потом продолжить его снова с того же места — вся молекула РНК должна появиться за один раз. Чтобы понять, как работает активный центр РНК-полимеразы, я сравниваю ферменты термофильных и мезофильных бактерий, которые сильно различаются по скоростям синтеза РНК — из-за того, что в норме работают при разных температурах. Путем «скрещивания» таких РНК-полимераз мне удалось получить химерные варианты фермента с самыми разными свойствами, в том числе медленные и быстрые РНК-полимеразы. В результате были найдены как раз те районы активного центра, которые участвуют в синтезе РНК и отвечают за отличия в свойствах полимераз термофилов [9].
Другое направление нашей работы — аптамеры к РНК-полимеразе, которые можно использовать для исследований транскрипции. Аптамеры — это своего рода аналог белковых антител, но в отличие от антител они состоят из нуклеиновых кислот (в нашем случае — это короткие однонитевые молекулы ДНК) и могут быть получены с помощью отбора в пробирке, без использования живых систем. Мы получили аптамеры к РНК-полимеразе, которые очень крепко с ней связываются и при этом различают ферменты разных бактерий. В результате мы смогли увидеть различия в узнавании ДНК разными РНК-полимеразами. Оказалось, что аптамеры можно использовать и для быстрого выделения РНК-полимераз из клеток бактерий. А благодаря тому, что они связываются с теми же участками фермента, что и матричная ДНК, аптамеры с большой эффективностью подавляют активность РНК-полимеразы [10–12]. Теперь их можно использовать для получения новых антибиотиков и ингибиторов РНК-полимеразы!
Дарья Есюнина недавно защитила кандидатскую диссертацию и является автором статей в ведущих международных журналах [13], [14]. Работа Дарьи посвящена изучению процессов транскрипции и ее регуляции у разных бактерий, в том числе экстремофилов — микроорганизмов, которые способны жить в экстремальных условиях: при высоких температурах, огромных дозах радиации. О некоторых результатах работы Дарьи можно прочитать в статье про регуляцию транскрипции белками бактериофагов [15].
Дарья Есюнина. Женская половина лаборатории очень любит разноцветные бактерии.
— Синтез РНК — не единственная активность РНК-полимеразы во время транскрипции. Иногда полимераза ошибается, вставляя напротив основания матричной цепи ДНК неправильный нуклеотид. При этом синтез останавливается, а РНК-полимераза смещается назад по матричной ДНК, благодаря чему 3’-конец РНК покидает активный центр фермента. Это позволяет клетке избежать появления нефункциональных транскриптов и сэкономить энергию и нуклеотиды. Однако стоящая на месте РНК-полимераза тоже не нужна клетке. Поэтому в активном центре фермента происходит отщепление фрагмента РНК, содержащего ошибку, после чего РНК-полимераза может продолжить синтез. В моей работе мне удалось понять, какие участки активного центра отвечают за реакцию расщепления и как эта реакция регулируется различными клеточными факторами [14].
Эти элементы РНК-полимеразы нужны для расщепления РНК-транскрипта. Слева — структура полимеразы, справа — активный центр крупным планом.
Кажущиеся иногда однообразными эксперименты при появлении первых важных результатов вдохновляют на получение всё новых и новых мутаций в РНК-полимеразе — как бы так ее элегантно поломать, чтобы работала только наполовину, или только при подогреве, или на холоде, или только с помощью других белков. Вариантов масса, и за каждым скрывается ответ на вопрос, как устроена и работает эта молекулярная машина. Кто-то скажет, что это слишком детально, сложно интерпретируемо, вообще не про человека и тем более не про рак. Но, во-первых, стόит помнить, что в каждом из нас живет пара килограммов бактерий, миллиарды миллиардов РНК-полимераз которых каждую секунду что-то синтезируют, где-то останавливаются, сталкиваются с другими полимеразами, а иногда мутируют, чтобы стать устойчивыми к новому антибиотику. Во-вторых, они так похожи на РНК-полимеразы эукариот, что многие фундаментальные данные, полученные на бактериях, могут найти подтверждение и в «человеческой» транскрипции. Понимание работы РНК-полимеразы кишечной палочки — это как первый уровень в компьютерной игре — не пройдя его, невозможно пройти десятый: например, понять, как регулируется экспрессия генов в мозге игрока (ну или в нашем случае — молекулярного биолога).
Продолжает Алексей Агапов, аспирант:
— Разнообразие в работу молекулярного биолога вносит интересный объект. Несомненно, кишечная палочка, на которой до сих пор проводится большинство «бактериальных» работ, — прекрасный организм. Но мир настолько разнообразен, и границы жизни так широки, что будет непростительно не узнать, каким образом это оказывается возможным с молекулярной точки зрения. Что может быть особенного в транскрипции у экстремофилов, что обеспечивает их приспособление к суровым (конечно, с нашей точки зрения) условиям существования? В качестве одного из объектов мы используем уникальную бактерию Deinococcus radiodurans. Она интересна тем, что обладает феноменальной устойчивостью к ионизирующему излучению, ультрафиолетовому свету, обезвоживанию, окислительному стрессу [16]. Еще бы — ведь она была обнаружена в стерилизованных гамма-облучением консервах! В последнее время довольно много работ было посвящено выявлению механизмов такой удивительной стрессоустойчивости на молекулярном уровне. Примечательно, что каких-то уникальных механизмов пока так и не найдено — похоже, что работает сумма факторов: эффективные системы репарации, защита от окислительного стресса. Однако про механизмы регуляции транскрипции у дейнококка известно очень мало. Поэтому мы просто не могли удержаться от исследования работы РНК-полимеразы и транскрипционных факторов этой замечательной бактерии. Выращивали десятки литров прекрасной розовой культуры, похожей на свежевыжатый грейпфрутовый сок и особенно полюбившейся женской половине лаборатории, чтобы после нескольких неудачных попыток наконец-то получить желанную пробирку с парой десятков микролитров РНК-полимеразы. В результате нам удалось показать, что полимераза дейнококка способна гораздо быстрее расщеплять синтезируемую РНК, чем полимераза кишечной палочки, что, вероятно, позволяет быстро исправлять ошибки транскрипции (иначе в ядерном реакторе не выжить!) [14], [17]. Мы на этом не останавливаемся и продолжаем поиск уникальных свойств транскрипционного аппарата D. radiodurans.
Алексей Агапов измеряет очень быструю кинетику синтеза РНК
Еще одна важная проблема — понять, как повреждения в молекуле ДНК влияют на работу РНК-полимеразы: останавливается ли она, синтезирует ли неправильную молекулу РНК или привлекает факторы репарации? Хорошо известно, что РНК-полимераза служит сенсором повреждений ДНК [18], но как именно происходит узнавание повреждений, взаимодействие с регуляторными факторами? Этим вопросам, в частности, посвящена кандидатская диссертация еще одного аспиранта нашей лаборатории, Артема Игнатова. Чтобы понять, как работает РНК-полимераза, в ход идут самые изощренные методы: и флуоресценцию измеряем, и межмолекулярные сшивки делаем, и гамма-радиацией клетки облучаем. Последние приобретения лаборатории — высокочувствительный флуориметр и прибор для измерения быстрых ферментативных реакций. Их разрешающая способность — несколько миллисекунд. Так что теперь от нас никакая полимераза не ускользнет.
Данил Пупов представляет свои результаты на конференции в Кембридже
Данил Пупов — к.б.н., старший научный сотрудник ЛМГМ, проводит исследования инициации транскрипции РНК-полимеразой:
— От меня точно ни одна полимераза не ускользнет! Благодаря мутациям, которые я внес в бактериальный сигма-фактор — главный фактор инициации транскрипции, — РНК-полимераза не может начать синтез РНК без добавления готовой РНК-затравки. Как известно, сигма-субъединица необходима для узнавания промоторных участков на ДНК — особых знаков для РНК-полимеразы, указывающих ей с какого места нужно начать транскрипцию. Представьте, насколько это важно: можно долго и старательно присоединять нуклеотиды и растить РНК, но всё не будет иметь смысла, если начать это делать в неправильном месте. Работы нашей лаборатории внесли вклад в понимание механизмов узнавания промоторов. А теперь мы еще знаем, каким именно образом происходит связывание первых нуклеотидов РНК после узнавания промотора. Оказалось, что сигма-субъединица играет в этом самую непосредственную роль и помогает удержать нуклеотидные субстраты и короткие РНК в активном центре фермента [19], то есть ее функции не ограничиваются только узнаванием промотора! В совместной работе с нашими американскими коллегами была расшифрована трехмерная структура инициаторного комплекса РНК-полимеразы, которая полностью согласуется с биохимическими данными [20].
Надо сказать, что после начала синтеза РНК проблемы РНК-полимеразы не заканчиваются: теперь надо оторваться от промотора, с которым она крепко связана за счет той же самой сигма-субъединицы. Оказалось, что и здесь сигма-фактор принимает активное участие: происходит столкновение растущей РНК и сигма-субъединицы, что вызывает ее диссоциацию и разрыв контактов с промотором.
В настоящее время я занимаюсь исследованием сигма-субъединицы и инициации транскрипции новыми методами флуориметрии и начал разработку тестов, чтобы понять, как это работает в живых клетках. Но помимо этого в лаборатории я помогаю студентам и сотрудникам победить страхи при работе со сложными приборами!
Иван Петушков, аспирант:
— Я хочу продолжить рассказ Данила и пояснить, что происходит после инициации транскрипции. Даже после ухода с промотора синтез РНК прерывается паузами. Сейчас известно, что полимераза останавливается примерно через каждые 100–200 нуклеотидов. Для некоторых пауз была показана регуляторная роль, но функции большинства остаются загадочными. Первым известным примером регуляторной роли пауз стало открытие хорошо известного явления аттенюации в триптофановом опероне. Пауза нужна для того, чтобы рибосома могла догнать полимеразу перед последовательностью аттенюатора, иначе никакой точной и аккуратной регуляции концентрации триптофана в клетке не будет. Также паузы нужны для того, чтобы полимераза могла дождаться связывания транскрипционных факторов — например «антитерминаторов», которые подавляют преждевременную остановку транскрипции.
В нашей работе мы исследуем как сами механизмы образования пауз транскрипции, так и регуляцию этого процесса разными клеточными и фаговыми белками. Например, в недавнем исследовании с моим участием было обнаружено, что за узнавание определенного нуклеотида ДНК в точке паузы отвечает специальный карман в РНК-полимеразе [21]. Еще недавно считалось, что контакты полимеразы с ДНК в ходе синтеза РНК должны быть неспецифическими («иначе всё застрянет»), но оказалось, что это не так! Другая распространенная разновидность пауз — сигма-зависимые паузы. Долгое время все были уверены, что при уходе с промотора сигма-субъединица обязательно отделяется от РНК-полимеразы (ведь промотор уже опознан, ДНК расплавлена, синтез РНК начался) — но и это не так! Последние данные говорят о том, что большая часть элонгационных комплексов, покинувших промотор, содержит сигма-субъединицу. Более того, это не просто безбилетная пассажирка: сигма-субъединица может узнать участки ДНК, напоминающие промотор, и остановить в них полимеразу. Мы показали: когда сигма-фактор «цепляется» за ДНК, транскрипция останавливается не сразу — РНК-полимераза отчаянно пытается продолжить синтез РНК и «проглатывает» лишнюю ДНК. В результате образуется напряженный комплекс, и либо сигма-субъединица «отпускает» сигнал паузы, либо полимераза смещается назад и надолго останавливается. Наше последнее открытие показывает, что такие паузы могут образовываться не только с участием главной, но и с некоторыми альтернативными сигма-субъединицами (а их в разных бактериях может быть очень много — больше 100!). Теперь надо понять, какую роль в регуляции генов могут играть эти паузы.
Так происходит узнавание сигналов пауз транскрипции.
Антибиотики и горизонтальный перенос генов
Рассказывает Майя Петрова, д.б.н., заведующая Сектором анализа и хранения микроорганизмов, входящим в ЛМГМ.
Майя Петрова отбирает образцы вечной мерзлоты — холодно даже летом
— Еще одно направление работы нашей лаборатории — исследование механизмов горизонтального переноса генов у бактерий, изучение структуры и эволюции генов устойчивости к тяжелым металлам и антибиотикам. Горизонтальный перенос генов — это процесс, в котором организм передает генетический материал другому организму, не являющемуся его потомком. Центральную роль в этом процессе играют различные мобильные генетические элементы — плазмиды, транспозоны, IS-элементы, интегроны [22]. В последние годы появилось четкое понимание того, что горизонтальный перенос генов относится к ведущим механизмам эволюции бактерий. Одно из самых нежелательных для человека последствий этого явления — быстрое распространение множественной устойчивости к антибиотикам среди клинических штаммов [23].
В ЛМГМ исследования горизонтального переноса генов у природных бактерий были начаты еще в 1983 г. по инициативе Р.Б. Хесина. Основные усилия были направлены на изучение структуры генов устойчивости к ртути и мобильных элементов, участвующих в их горизонтальном переносе. Позже данная работа получила очень интересное развитие — мы стали искать гены устойчивости в бактериях, выделенных из вечной мерзлоты. Такой подход позволил нам исследовать бактерии, не подвергавшиеся антропогенным воздействиям, и выяснить природные пути происхождения и переноса различных генов устойчивости к тяжелым металлам и антибиотикам. В результате этой работы впервые в мире у древних бактерий были обнаружены гены устойчивости к антибиотикам и участвующие в их переносе мобильные элементы. Замечательно, что многие из них оказались идентичны генам, найденным в современных клинических бактериях [24–26]. Это прямо подтверждает гипотезу о том, что гены антибиотикоустойчивости попали в патогенные клинические штаммы из природных бактерий. Резистентность к антибиотикам имеет глубокие эволюционные корни и существовала задолго до начала их применения человеком!
Схема переноса генов устойчивости к антибиотикам из природных бактерий в клинические штаммы
Основные источники поступления антибиотиков в биосферу и глобальная сеть путей горизонтального переноса генов устойчивости к ним. Красными стрелками показано поступление антибиотиков, оранжевыми — перемещение антибиотиков и генов устойчивости к ним, голубыми — передача только генов устойчивости.
Сотрудничество, гранты
— И это далеко еще не всё, чем занимается наша лаборатория, — продолжает Андрей Кульбачинский. — Мы начинаем новые проекты в различных областях бактериальной транскрипции, стараемся не пропустить чего-то интересного. К сожалению, не на всё хватает времени, «рук» и лабораторного пространства. Совсем недавно в лаборатории образовалась новая группа — специализированных ДНК-полимераз, — которую возглавляет к.б.н. Алена Макарова. Интересно, что ДНК-полимеразы в принципе катализируют ту же самую реакцию полимеризации нуклеотидов, что и РНК-полимеразы, и поэтому исследуются похожими методами. Но, конечно, они выполняют совсем другие функции — например, специализированные ДНК-полимеразы эукариот, которые исследует Алена, обеспечивают репликацию поврежденных участков ДНК в стрессовых условиях и ответственны за мутагенез [28]. После защиты кандидатской диссертации (которую она выполняла в Лаборатории репликации и репарации генома в нашем институте) Алена работала в ведущих зарубежных лабораториях, занятых проблемами репликации ДНК, а потом вернулась в наш институт и получила собственные гранты — в том числе гранты фонда «Династия» и программы «Молекулярная и клеточная биология». Будем надеяться, что наше с ней сотрудничество продолжится, и в дальнейшем мы узнаем что-то о взаимодействиях ДНК- и РНК-полимераз (которые постоянно встречаются на матрице ДНК).
Должен сказать, что наша работа на современном уровне была бы невозможна без двух факторов: поддержки со стороны научных фондов (РФФИ, РНФ, программа «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН, гранты Президента РФ для молодых ученых) и активного сотрудничества с нашими коллегами в России и других странах: США, Великобритании, Франции, Финляндии, Литве. Благодаря этим контактам мы можем научиться самым современным методам исследований, обменяться необходимыми опытом и материалами. Многие сотрудники лаборатории за ее долгую историю разъехались по разным странам, стали там заведующими лабораториями, но мы стараемся не терять с ними связи и выполнять совместные исследования.
Проблемы
— Не могу не рассказать и о непрекращающихся проблемах в нашей научной жизни. К сожалению, после передачи институтов РАН в ФАНО у нас совершенно нет уверенности в благополучном существовании. Возникает ощущение, что в любой момент может произойти очередная реорганизация, слияние, ликвидация и тому подобное. Как заведующий лабораторией, я всё время вынужден участвовать в ответах института на непрерывные формальные запросы ФАНО. Единственный положительный результат этих преобразований — это то, что ничего по-настоящему плохого пока не случилось. Но есть и отрицательные: например, успешная программа РАН по предоставлению жилья молодым ученым была полностью формализована, и сейчас получить субсидию на квартиру в Москве практически невозможно. Большинство моих молодых сотрудников и аспирантов приехали из других городов, и их дальнейшая работа очень сильно зависит от того, найдут ли они себе жилье или нет.
Недавняя проблема — резкое сокращение финансирования программ фундаментальных исследований РАН, в частности, программы «Молекулярная и клеточная биология». А ведь эти программы являются сейчас чуть ли не единственным способом прямого участия РАН в научных исследованиях. По всем критериям — и по научной значимости результатов, и по уровню публикаций, и по оценке экспертов, — в программе «Молекулярная и клеточная биология» участвуют действительно ведущие научные коллективы нашей страны в этой области (а их не так много). И что же — в 2015 году деньги на исследования приходят в урезанном виде в сентябре, а финансирование на 2016 год сокращается еще как минимум в 2 раза! В 2015 году ликвидирован фонд «Династия» — а он, в частности, поддерживал молодых биологов, работающих в области молекулярной биологии.
Сейчас в связи с колебаниями курсов валют цены на большинство необходимых реактивов (не говоря уже о приборах) возросли в 2–3 раза, хотя объемы грантов не увеличиваются, а сокращаются. При этом не исчезает и проблема с доставкой материалов из-за границы: некоторые реактивы по-прежнему приходится ждать месяцами, наш рекорд прошлого (и позапрошлого!) года — 13 месяцев.
В последнее время все академические институты заняты еще и подготовкой документов по аспирантуре по новому образовательному стандарту. Я не берусь критиковать этот стандарт сам по себе, но число формальных и часто бессмысленных бумажек зашкаливает: это более 100 документов (некоторые по 200 страниц), которые нужно писать, подписывать, сканировать и т.д. При этом совсем не учитываются особенности аспирантуры в научных учреждениях. Ну что же — приходится тратить время, оформлять документы и надеяться, что и это мы тоже переживем!
Перспективы
— К счастью, несмотря на проблемы, мы не останавливаемся и продолжаем работать. Состав лаборатории постоянно обновляется: у нас работают студенты и аспиранты МГУ имени М.В. Ломоносова, МИТХТ имени М.В. Ломоносова, многих из них нам удается удержать в лаборатории и после защиты диссертации. Три молодых сотрудника, ведущих основные исследования в области бактериальной транскрипции, стали кандидатами наук под моим руководством, еще три аспиранта работают над диссертациями. Вообще, сейчас бóльшая часть людей в лаборатории уже младше меня — хотя, кажется, совсем недавно все были старше. Именно общение со студентами, семинары и лекции, которые я читаю в МГУ и в научно-образовательном центре нашего института, помогают быть в курсе современных исследований в различных областях молекулярной биологии. Уже не раз происходило так, что рассказ о каких-то последних открытиях на лекции для студентов становился началом нового проекта в лаборатории.
Мы исследуем центральные механизмы, лежащие в основе генетической регуляции у всех организмов. А это значит, что тема не теряет своей актуальности и сейчас, в постгеномную эру. Наоборот, появление геномных данных позволяет обнаружить новые, совершенно неожиданные факторы и системы генетической регуляции. Возможно, наиболее интересным сейчас является изучение связи транскрипции с другими генетическими процессами в клетке — а у бактерий транскрипция связана буквально со всем: репликацией, репарацией, рекомбинацией ДНК, горизонтальным переносом генов, трансляцией. Парадоксально, но до последнего времени ученые, исследующие эти процессы, очень мало взаимодействовали друг с другом (в отличие от молекул!). Мы стараемся этот пробел восполнить и сейчас собираем все эти системы в одной пробирке.
«Игроки» — работа в лаборатории глазами заведующего
Из смешного
Заходите на наш сайт! Ну и читайте научные публикации!
Статья написана при участии И. Петушкова, Д. Есюниной, А. Агапова, М. Петровой и С.З. Миндлин.