что такое гликокаликс животной клетки

Что такое гликокаликс животной клетки

В основе многих патологических состояний лежат расстройства эндотелия. Общепринято, что микроальбуминурия при гломерулонефрите, преэклампсии и сепсисе связана с дисфункцией эндотелия. Полиангиопатии, характерные для сахарного диабета, также являются следствием поражения эндотелия. Однако механизмы этих расстройств до последнего времени оставались не до конца понятными. Причиной эндотелиальной дисфункции долгое время считалась сама эндотелиальная клетка, при том что еще в 50-х годах ХХ века на поверхности эндотелиальных клеток обнаружено некое однородное нечеткое покрытие [1], которому в то время не придали особого значения. Как выяснилось впоследствии, именно оно оказалось защитной стеной между кровотоком в сосуде и поверхностью самого эндотелиоцита [2]. Это образование, состоящее из гликопротеинов, протеогликанов и глигозаминогликанов [3, 4] и являющееся интегральной частью эндотелия, получило в дальнейшем название «гликокаликс». Последующие исследования выявили фундаментальную роль, которую играет гликокаликс в процессах регуляции кровотока, воспаления и коагуляции.

В этом обзоре мы постараемся рассмотреть строение и физиологию гликокаликса, а также патофизиологию и клиническое значение повреждения и полного уничтожения гликокаликса.

Краткая предыстория вопроса или «откуда он взялся?»

Наличие слоя протеинов на эндотелии впервые постулировано J. Danielli в 1940 г. [5]. В середине 50-х годов XX века G. Palade одним из первых указал на наличие однородного нечеткого покрытия на поверхности эндотелиальных клеток [1].

До того, как термин «гликокаликс» стал общепризнанным, эту структуру именовали как «клеточная стенка», «поверхностный клеточный слой», «мукозное антигенное покрытие», «кутикулярный эритроцитарный антиген» и др. [1, 6, 7]. В 1963 г. H. Bennett [8] предложил термин «гликокаликс» как общее название для этого «внеклеточного сахаридного покрытия», где бы оно ни находилось. Гликокаликс по-гречески означает «сладкая оболочка».

Визуализация гликокаликса сдерживалась отсутствием необходимых методик окрашивания и фиксации, которые не разрушали бы эту хрупкую структуру [3]. В 1966 г. J. Luft [7] был первым, кто предложил использовать рутений красный для визуализации гликокаликса при электронной микроскопии и выявил «тонкую структуру капилляров и эндокапиллярного слоя». Исследования физиологической роли гликокаликса начались в 70-х годах XX века с изучения изменений капиллярного гематокрита, вызванных как физиологическими раздражителями, так и разрушением гликокаликса [9, 10].

В 2003 г. B. van den Berg [4] с помощью электронной микроскопии визуализировал ворсинчатую структуру гликокаликса левого желудочка сердца крысы (рис. 1). Рис. 1. Гликокаликс левого желудочка сердца крысы; ворсинчатая структура гликокаликса (справа) [2]. В последние десятилетия накапливаются данные, свидетельствующие о ключевой роли, которую играет гликокаликс в защите сосудистого русла, модуляции воспаления и гемостазе [3—5].

Строение и свойства

Гликокаликс — это сложная гелеподобная структура, расположенная между протекающей кровью и эндотелиально-клеточной стенкой сосуда. Современные методики позволяют визуализировать гликокаликс, он обнаружен на протяжении всего сосудистого русла от крупных сосудов до мельчайших капилляров [3—6]. Его общая площадь у человека составляет в среднем 350 м 2 [6].

Гликокаликс вырабатывается эндотелием и располагается в критической зоне раздела тока крови и эндотелиальных клеток [11]. Гликопротеиновый гликокаликс окутывает весь здоровый сосудистый эндотелий. Это составная часть сосудистого барьера [11, 12]. Он взаимодействует с белками и липидами плазмы [13]. Состав и размеры гликокаликса непрерывно меняются, так как протекающая плазма постоянно слущивает его молекулы [14]. Толщина гликокаликса различна на всем протяжении сосудистого русла и составляет по одним данным от 0,1 до 1 мкм [15], по мнению других исследователей, достигает 3 мкм [5]. Толщина гликокаликса в микрососудах может быть определена в подъязычных тканях методом ортогональной поляризационной спектральной визуализации и хорошо коррелирует с результатами дилюционных методик [16] (рис. 2). Рис. 2. Структура гликокаликса. ICAM — интерцеллюлярные молекулы адгезии. РЕСАМ-1 — тромбоцито-эндотелиальные молекулы адгезии 1-го типа; CD44 — эндотелиальные поверхностные рецепторы.

Гликопротеины и протеогликаны формируют основу гликокаликса [6, 11]. Гликопротеины, как правило, это то, что мы себе представляем как рецепторы на поверхности клетки: селектины, интегрины и другие функционально-динамические белки клеточной поверхности [17].

Протеогликаны играют роль стромы гликокаликса и состоят из стволовых белков, плотно прикрепленных к клеточной мембране, к которым в свою очередь прикрепляются отрицательно заряженные боковые цепочки гликозаминогликанов (ГАГ). Протеогликаны различаются по размеру своих протеиновых основ, количеству прикрепленных ГАГ и способам крепления к мембране клетки. Некоторые протеины гликокаликсной основы прочно прикреплены к мембране клетки посредством мембранно-связующего домена (синдеканы), другие — с помощью гликозилфосфатидилинозитолового якоря (глипиканы). Остальные белки основы — перлеканы, версиканы, декорины, бигликаны и мимеканы секретируются после прикрепления боковых цепей ГАГ [5].

Гликопротеины и протеогликаны синтезируются и формируются в несколько этапов по мере того, как они внутриклеточно выделяются из эндоплазматического ретикулума к аппарату Гольджи и, наконец, соединяются с мембраной клетки [17].

ГАГ можно рассматривать как растворимые соединения, в виду того что они синтезируются внеклеточно и позже связываются с протеогликанами и гликопротеинами.

Известны 5 типов гликозаминогликановых цепей: гепарансульфат (ГС), составляющий 50—90%, а также гиалуроновая кислота (ГК) (гиалурононан), хондроитин-, дерматан- и кератинсульфат. Некоторое время назад считали, что ГК — единственная из ГАГ, не связанная с белковой основой и образующая вязкие растворы с водой [4]. Однако затем установлено, что ГК связывается с эндотелиальным поверхностным рецептором CD44 [18, 19]. Именно взаимодействие ГК/CD44 обусловливает фильтрующие свойства молекулярного сита гликокаликса [19].

Гликокаликс формирует на поверхности эндотелиальной клетки сетчатую структуру, позволяющую связывать белки плазмы и растворимые ГАГ [3, 5, 13]. Гликокаликс сам по себе не активен, но как только компоненты плазмы связываются с ним, он формирует физиологически активный эндотелиальный поверхностный слой (ЭПС) [20].

Гликопротеины играют роль молекул адгезии и, участвуя в коагуляции, являются частью систем гемостаза и фибринолиза. Молекулы клеточной адгезии делятся на селектины (Е и Р), интегрины и иммуноглобулины. Гистамин и тромбин стимулируют экспрессию Р-селектина, тогда как интерлейкин (IL-1), фактор некроза опухоли α (TNF-α) и липополисахариды стимулируют экспрессию Е-селектина. Интегрины связаны с коллагеном, фибронектином и ламинином в субэндотелиальный матрикс и регулируют взаимодействие тромбоцитов с эндотелиальной клеткой.

Иммуноглобулины включают интерцеллюлярные молекулы адгезии 1-го и 2-го типов (ICAM-1, ICAM-2), молекулы адгезии сосудистого эндотелия 1-го типа (VCAM-1) и тромбоцитоэндотелиальные молекулы адгезии 1-го типа (PECAM-1). Они являются лигандами для интегринов на лейкоцитах и тромбоцитах, участвуя в адгезии к эндотелию и в диапедезе [5].

Гликокаликс имеет отрицательный заряд, что определяет его взаимодействие с компонентами плазмы. Отрицательный заряд зависит от сульфатации боковой цепи ГАГ, тип которой изменяется во времени, а также под влиянием физиологических и патофизиологических стимулов. Изменения в типе сульфатации влияют на связывание белков и сосудистую проницаемость [5].

Заряженная сетка гликокаликса действует как макромолекулярное сито [3], отталкивая отрицательно заряженные молекулы, а также эритроциты и тромбоциты [4]. Макромолекулы массой более 70 кДа отторгаются гликокаликсом. Несмотря на то что альбумин имеет сетевой отрицательный заряд и массу 67 кДа, он крепко связывается с гликокаликсом благодаря своей амфотерной природе, к тому же, он несет слабый положительный заряд вдоль белковой цепи [6]. Связка гликокаликс—альбумин снижает гидравлическую проводимость через сосудистый барьер [11]. Некоторое количество альбумина проникает через гликокаликс с коэффициентом отражения 0,75—0,95 для различных типов капилляров [21]. В норме альбумин проникает через гликокаликс в интерстиций со скоростью 5% от его общего плазменного объема в час [21].

Гликокаликс отталкивает эритроциты. Это выглядит как зона отчуждения, идущая параллельно эндотелиальному слою и выстраивающая эритроциты в центрированную колонну. Эта зона отчуждения суживается при повреждениях гликокаликса [5].

Гликокаликс демпфирует взаимодействие тромбоцитов и лейкоцитов. Во-первых, его отрицательный заряд отталкивает клетки, а во-вторых, молекулы адгезии, такие как PECAM, VACM и ICAM, скрывающиеся внутри его структуры [5, 15], становятся менее доступными. Интегрины и селектины способствуют адгезии моноцитов и многоядерных нейтрофилов. Кроме того, ICAM-1, ICAM-2, VCAM и PECAM участвуют во взаимодействии клеток крови со стенкой сосуда и адгезии во время диапедеза [22].

Как уже сказано, вся структура гликокаликса в целом вместе с находящимися в нем молекулами и экстравазированной плазмой называется эндотелиальным поверхностным слоем (ЭПС). Он защищает эндотелиальные клетки от избыточного слущивания, вызванного током крови [6]. Вместе с тем повышение слущивания эндотелия вызывает увеличение синтеза оксида азота, который в свою очередь расширяя сосуды, уменьшает стресс [23]. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека под воздействием слущивания удваивают продукцию ГК в гликокаликсе. Это также является механизмом, способным компенсировать слущивание [13]. Повреждения гликокаликса нарушают оба эти механизма и снижают устойчивость эндотелия к слущиванию [24].

Связывание лигандов и ферментов с эндотелиальным гликокаликсом способствует клеточной сигнализации и ферментативной модификации [5], например, функционирование фактора роста фибробласта зависит от взаимодействия лиганда и рецептора внутри гликокаликса [25]. Гликокаликс вовлечен также и в липолитическую систему, так как связывает липазу липопротеина с ее лигандом [4].

Некоторые антикоагулянтные медиаторы могут связываться с гликокаликсом. Антитромбин III является ингибитором тромбина и активированных факторов IX и Х. Его антикоагулянтная активность увеличивается при присоединении к ГС, который является одним из ГАГ, обнаруживаемых в гликокаликсе. Гепариновый кофактор II активируется дерматансульфатом, также находящимся в гликокаликсе. Тромбомодулин продуцируется эндотелиальными клетками и содержит еще один ГАГ, хондроитинсульфат, который взаимодействует с тромбином при активации антикоагулянтного каскада протеина С. Ингибитор каскада тканевого фактора связывается с ГС и ингибирует VIIa и Ха [22].

Еще одним механизмом, с помощью которого гликокаликс защищает эндотелий, является его способность связывать ферменты, блокирующие свободные радикалы кислорода, такие как внеклеточная супероксиддисмутаза. Эти ферменты помогают снизить окислительный стресс и поддерживать биодоступность NO, предотвращая таким образом эндотелиальные дисфункции [4].

Скорее всего, до полноты представления о строении и функциях гликокаликса еще достаточно далеко, и исследователи находятся лишь в начале пути.

Деструктивные факторы и слущивающий (shear) стресс

ЭПС на удивление хрупок. Например, ишемия с реперфузией разрушают ЭПС воздействием свободных кислородных радикалов. Так, 20-минутная ишемия при температуре 37 °C с последующей реперфузией способна вызвать почти полное разрушение гликокаликса [26].

Сосудистый эндотелий — одна из самых первых структур, вовлекаемых в синдром системного воспалительного ответа [15]. Сосудистый эндотелий повреждается при воздействии TNF-α и бактериального липополисахарида. Тучные клетки, активированные TNF-α, высвобождают цитокины, протеазы, гистамин и гепариназу, что усугубляет деструкцию гликокаликса.

Потеря ГАГ ведет к утончению и уплотнению гликокаликса. При этом теряются в основном ГС, хондроитинсульфат и ГК [27, 30]. Уплотнение гликокаликса при потере ГАГ сохраняет его способность препятствовать капиллярной утечке, несмотря на уменьшение толщины и возможное увеличение проницаемости [27]. Уплотнение гликокаликса, появление циркулирующих в плазме ГС [28, 29], ГК [30] или хондроитина [31] служат маркерами повреждения гликокаликса. Это называют «линькой», «слущиванием» или «слущивающим стрессом» (shear-stress) [11, 32] (рис. 3). Рис. 3. Слущивающий стресс (shear-stress). ICAM — интерцеллюлярные молекулы адгезии; РЕСАМ-1 — тромбоцито-эндотелиальные молекулы адгезии 1-го типа; CD44 — эндотелиальные поверхностные рецепторы. Деструкция гликокаликса освобождает молекулы адгезии, служа триггером дальнейшего воспаления, вызывая соприкосновение эритроцитов и тромбоцитов со стенкой сосуда с последующей адгезией [15].

Концентрация синдекана — протеогликана, важнейшего компонента гликокаликса, возрастает в плазме при усиленном слущивании последнего [28, 33, 34].

К настоящему времени известны медиаторы воспаления, разрушающие гликокаликс, включают С-реактивный белок [35], стимуляторы рецептора аденозина А₃ [36, 37], TNF-α [38], брадикинин [39] и триптазу тучных клеток [40].

Из результатов последних клинических исследований становится очевидным, что гликокаликс повреждается при системных воспалительных состояниях и других расстройствах, таких как сепсис [33, 41], гипергликемия [42], хирургическая агрессия [28], травма [34] и сахарный диабет [30].

Последствия деструкции гликокаликса от слущивающего стресса нарушают морфологию эндотелиоцитов и влияют на их функциональные возможности [32]. Разрушение гликокаликса может приводить к капиллярной утечке, отеку, резкому воспалению, агрегации тромбоцитов, гиперкоагуляции и потере сосудистой управляемости [15] (рис. 4). Рис. 4. Последствия деструкции гликокаликса.

Повышенная концентрация ГАГ в плазме обнаружена у больных септическим шоком и, как выяснилось, приводила к снижению антибактериальных свойств плазмы [43]. Высокие плазменные концентрации компонентов гликокаликса, отмеченные у септических больных, свидетельствуют о его деструкции и коррелируют с высокой летальностью [43]. Ряд других молекул, выделенных из эндотелия и плазмы и участвующих в процессах коагуляции и воспаления, содержатся в гликокаликсе.

Гипергликемия является одним факторов, разрушающих гликокаликс. У больных сахарным диабетом I типа толщина гликокаликса в 2 раза меньше, чем у здоровых, а у больных диабетом с микроальбуминурией гликокаликс еще тоньше [30]. В том же исследовании у больных диабетом в плазме отмечены высокие концентрации ГК и гиалуронидазы вследствие повышенного слущивания в поврежденном гликокаликсе. При гипергликемии повреждение может быть вызвано кислородными радикалами либо активацией ферментов, деградирующих гликокаликс. Очевидно, что необходимы дальнейшие исследования по изучению вклада расстройств ЭПС в патогенез микроангиопатий при диабете [30, 42, 44].

Гликокаликс утончается при употреблении пищи с высоким содержанием жиров и холестерина, способствуя атерогенезу [45]. Инфузии клинически значимых доз окисленного липопротеина низкой плотности вызывают деструкцию гликокаликса у хомяков и приводят к локальной адгезии тромбоцитов [46].

Быстрая внутривенная инфузия кристаллоидов в опытах на добровольцах приводила к значительному повышению уровня ГК в плазме и поэтому была опасной [47]. У пациентов после острой гиперволемической гемодилюции в качестве процедуры предоперационного кровосбережения 60% инфузированного объема уходило в интерстициальное пространство в течение нескольких минут [48]. Массивная кровопотеря и сопровождающая ее ишемия с реперфузией также являются факторами деструкции [49].

Применение аппарата искусственного кровообращения (АИК) во время оперативных вмешательств также разрушает гликокаликс [47]. Гиповолемия повреждает гликокаликс и является триггером выброса предсердного натриуретического пептида, который оголяет ЭПС [50, 51]. В исследовании, проведенном еще в 1983 г., показано, что лидофлазин, блокатор кальциевых канальцев, ныне ассоциируемый с купированием желудочковых аритмий и пролонгацией интервала QT, защищал гликокаликс пациентов во время операций с АИК [52].

Нормальное функционирование почек возможно только при неповрежденном гликокаликсе. Только 0,06% альбумина может в норме проникать через почечный фильтр, при том что поры в гломерулярном слое значительно больше молекулы альбумина. Возможно, это происходит за счет отрицательного заряда гликокаликсного выстилающего слоя [53]. Микроальбуминурия является свидетельством системной эндотелиальной дисфункции и сердечно-сосудистых осложнений не только у больных диабетом, но также пациентов с обычной гипертензией и женщин с преэклампсией [54, 55].

Исследования с липидными каплями позволили определить, что толщина зоны отчуждения эритроцитов над гломерулярной эндотелиальной поверхностью составляет 175 нм. Причем под влиянием гиалуронидазы, гепариназы и хондроитиназы она еще более уменьшается. Деструкция гликокаликса увеличивает проницаемость гломерулярного капилляра для обычного альбумина, но не для фиколла (электрически нейтральный альбумин), свидетельствуя, что нарушения гликокаликса ведут к потере электрической избирательности [54]. После выполнения хирургических вмешательств на коронарных и периферических артериях отмечено возрастание плазменных концентраций компонентов эндотелиального слоя [15]. Электронная микроскопия позволяет выявлять обнаженные эндотелиальные клетки со слущенными и смытыми ГАГ, увеличением транссудата и проницаемости для коллоидов [56].

Маркеры деструкции гликокаликса

Из сказанного выше очевидно, что большинство, если не все, патологические состояния в организме связаны с той или иной степенью деструкции гликокаликса; поэтому возрастает актуальность вопроса прижизненной диагностики степени деструкции и дисфункции гликокаликса.

Микроальбуминурия

Появление и нарастание микроальбуминурии в сочетании с увеличением сосудистой проницаемости, выражающейся в появлении отеков, является следствием деструкции гломерулярного эндотелиума, часто наблюдаемой в клинике при остром септическом поражении почек [57]. У ряда пациентов соотношение микроальбуминурия/креатинин мочи (МАКС) коррелирует с оценкой тяжести в баллах по шкалам Surgical Stress Score [58], SOFA [59], APACHE II [60], Injury Severity Score [61] и SAPS II, а также с длительностью искусственной вентиляции легких и индексом оксигенации (P_aO₂/FiO₂) [62]. У пациентов с сепсисом высокие уровни МАКС появляются раньше, чем увеличение уровней С-реактивного белка и прокальцитонина [63]. Уровень микроальбуминурии сам по себе может служить маркером тяжести септического процесса [64].

Синдекан-1

Уровень синдекана-1, циркулирующего в кровотоке, зависит от степени эндотелиального повреждения и деструкции гликокаликса, а также коррелирует с уровнями воспалительных цитокинов [65]. У пациентов с травмой он ассоциируются с различными коагулопатиями и высокой летальностью [34]. Так как уровень синдекана-1 у больных с сепсисом выше, чем у остальных хирургических пациентов, он может служить биомаркером более тяжелой деструкции гликокаликса, учитывая, что синдекан-1 является белком его основы [33].

Эндокан

Эндокан является еще одним белком основы гликокаликса и может выделяться из него при воздействии IL-1 и TNF-α. Он может служить биомаркером у больных сепсисом. Величина свободного эндокана в плазме коррелирует со степенью тяжести септического процесса [66]. Высокие уровни эндокана в плазме у пациентов с тяжелой травмой ассоциируются с острым легочным поражением [67]. Таким образом, эндокан рассматривается как перспективный маркер эндотелиальной дисфункции при сепсисе [32].

Гликозаминогликаны

ГАГ, в частности ГС и ГК, являются одними из основных структурных элементов гликокаликса. Как уже указано, доля ГС среди всех ГАГ гликокаликса составляет 50—90% [4]. Деструкция гликокаликса вызывает появление в плазме высоких уровней ГАГ [28—30, 47]. Специфические структурные характеристики циркулирующих ГАГ могут дополнительно указывать на функциональное значение фрагментов гликокаликса. Так, дополнительно сульфатированные цепочки ГС могут проявлять биологическую активность, либо связываясь с антитромбином III и вызывая гепариноподобный эффект либо повышая взаимодействие факторов роста с рецепторами [68]. Эти биологически высоко активные субстанции могут значительно влиять на течение патологического процесса у пациентов в критических состояниях. Кроме того, ГС и фрагменты ГК могут сами по себе оказывать повреждающее действие на ткани, вызывая воспаление и микротравмы [69].

Показано, что количество циркулирующих ГС и ГК, а также модели сульфатации цепочек ГС различаются в зависимости от степени легочного поражения при остром респираторном дистресс-синдроме. Уровни свободных ГС коррелировали с продолжительностью пребывания в палате интенсивной терапии и летальностью [70]. Эти данные позволили сделать вывод, что уровень циркулирующих ГАГ может служить как диагностическим, так и прогностическим маркером тяжести состояния у пациентов с острой дыхательной недостаточностью [70]. Высокие уровни свободно циркулирующих ГАГ отмечены у больных с септическим шоком, и эти уровни коррелируют с уровнем летальности [43, 70].

Ангиопоэтины

Ангиопоэтины (Ang) являются новым, недавно признанным классом сосудистых факторов роста, играющих существенную роль в воспалительном процессе [71]. Ang-1 повышает структурную стабильность кровеносных сосудов, тогда как Ang-2 вызывает дестабилизацию и увеличивает сосудистую проницаемость [71]. Ang-1 и Ang-2 являются взаимно антагонистичными факторами, участвующими в важнейших процессах клеточной регуляции. У больных в критических состояниях высвобождение Ang-2 напрямую отражает расстройство сосудистого барьера [72]. В исследованиях показано, что Ang-2 резко повышен у больных септическим шоком, и его уровень коррелирует с летальностью [73]. К сожалению, рутинное измерение свободно циркулирующего Ang-2 в клинике пока невозможно.

Несомненно, список приведенных выше маркеров деструкции гликокаликса является далеко не полным, так как постоянно появляются результаты исследований, показывающих возможности использования все новых и новых субстанций в качестве маркеров эндотелиального поражения.

Последние два десятилетия отмечены бурным ростом числа исследований и публикаций, посвященных проблемам гликокаликса и эндотелиальной дисфункции. Это позволило по-иному оценить физиологию и патофизиологию эндотелия, увидеть глубину этой проблемы и те потенциальные выгоды, которые можно получить, изменив подходы к различным клиническим ситуациям, взглянув на них через призму гликокаликса.

Слой гликокаликса является хрупкой структурой и разрушается при быстрой внутривенной инфузии жидкостей, острой гипергликемии, хирургических вмешательствах и сепсисе. Исследования гликокаликса показали его вовлеченность практически во все патологические процессы. Наиболее значительные нарушения строения и функции гликокаликсного барьера отмечены при воспалении, ишемии, гипергликемии и даже гипо- и гиперволемии. При всех воспалительных состояниях целостность эндотелиального гликокаликса в различной степени нарушается. Особенно тяжелые повреждения отмечены при сепсисе. Вызванная воспалением деструкция гликокаликса может быть ответственной за ряд специфических клинических проявлений сепсиса, включая острое поражение почек, дыхательную и печеночную недостаточность.

В ХХ веке стал общепризнанным факт, что виновником многих клинических состояний является эндотелиит. Нынешнему веку удалось обнаружить структуру, регулирующую большинство функций эндотелия. Следующая задача — научиться предотвращать деструкцию и восстанавливать разрушенный гликокаликс.

Наука XXI века стоит на пороге рождения новой клинической парадигмы.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов: автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Источник

Жизнь без сахара — не сахар: третий алфавит в молекулярной биологии

Если одежка — углеводная, то по ней и встречают, и провожают, и вообще все свои взаимодействия осуществляют

иллюстрация автора статьи

Автор

Редактор

Как говорил Шекспир, вся наша жизнь игра, а люди в ней актеры. Удивительно, но эту аналогию можно применить и к живым организмам в целом. Тогда ДНК окажется сценарием, РНК будет интерпретацией этого сценария конкретным лицедеем (клеткой), белок — самой его игрой на сцене, действием. Но как же костюмный образ, сценическая импровизация, взаимодействия актеров, создающие всю магию спектакля? Верьте или нет, но этим занимаются посттрансляционные модификаторы, и, в частности, гликаны, что по сути своей являются сахарами. Представляем вам первую статью из цикла, посвященного гликобиологии.

Гликобиология

Сахар — это не только компонент кофе и булочек, топливо для мозга и вечно гонимый диетологами компонент рациона. Углеводы — одни из важнейших биоинформационных макромолекул, наравне с нуклеиновыми кислотами и белками. Именно этим удивительным веществам посвящен наш спецпроект.

Спонсор спецпроекта — «БиоХимМак» — поставщик научного и медицинского оборудования в лаборатории России и стран СНГ.

Мы все привыкли к клишированной фразе: «Сахар — это топливо для мозга». В ассоциативном ряду мы воспринимаем сахар как источник энергии, как безусловный компонент чаепития, как вечно гонимый диетологами компонент рациона. Это, безусловно, верно, ведь углеводы — сахара, клетчатка и крахмал — действительно являются главными источниками метаболической энергии для растений и животных. Помимо этого, прозорливые вспомнят структурную и запасающую роли углеводов (целлюлоза и крахмал растений).

Но мало кто припомнит, что бóльшая часть белков, ответственных за появление многоклеточной жизни, посттрансляционно (то есть по завершении синтеза белка) модифицируется сахарами. И мало кто сходу ответит, что углеводы — одни из важнейших биоинформационных макромолекул, стоящие наравне с нуклеиновыми кислотами и белками [1]. Но как так, спросите вы, это же просто сахар?

Ответы — ниже, в нашей первой статье спецпроекта о гликобиологии, организованного при поддержке компании «БиоХимМак».

Гликаны — что это за сахар, и почему его не насыпать в чай?

Развитие и функционирование организма — это невероятно сложные задачи. Количество и разнообразие биохимических процессов в клетке поистине огромно, и каждый биохимический процесс требует (как минимум) определенной структуры и функций участвующих в нем молекулярных компонентов. Вспоминая, что количество генов у обычной бактерии всего лишь в десять раз меньше, чем у высших эукариот, сложно представить, что только разнообразие белковых структур обусловило такое впечатляющее различие в сложности их организации. Огромный вклад в разнообразие функциональных возможностей белков внесли модификации, что происходят уже после их синтеза по шаблону, закодированному в геноме. И декорирование белков сахарными полимерами — гликозилирование — является не только самой распространенной посттрансляционной модификацией (около 50% всех белков нашего организма гликозилировано!), но и, пожалуй, обладает необходимым разнообразием и изменчивостью для не закодированной напрямую в геноме функциональной пластичности. Ведь гликаны синтезируются не по шаблону ДНК, а через многоступенчатую ферментативную систему, на которую влияют сотни генетических и внешних средовых факторов. Таким образом, в отличие от многих других посттрансляционных модификаций (например, фосфорилирования, сульфирования — да и вообще сейчас науке известно более 250 модификаций! [2]), работающих в большинстве своем как выключатель для белковой функции, гликозилирование вносит масштабнейший вклад в структуру и функцию белков. Важность этой модификации косвенно подчеркивается и тем, что почти все белки, появившиеся вместе с многоклеточностью, гликозилированы.

Dolce vita с начала времен: сахариды как оплот биогенеза

А вы и не знали, но существует даже теория углеводного возникновения жизни! Как и большинство эволюционных вещиц, ее, может, и не удастся неоспоримо доказать, но предпосылки возникновения весьма весомы.

Углеводы могут считаться исходными молекулами жизни, которые обеспечивают молекулярную основу для эволюции всего живого, потому что:

Подробнее, глубже и более научным языком про теорию углеводного возникновения жизни можно прочесть в оригинальной статье [10]. Есть и другие варианты углеводной модели биогенеза: возможно, все началось с одиночных аминокислот, что катализировали синтез простых сахаров, после чего уже сахариды могли править бал. Этой теории есть частичное экспериментальное подтверждение — треоза и эритроза могут синтезироваться из гликоальдегидов в присутствии L-аминокислот [11], а дезокси-D-рибоза может образоваться из протеиногенных аминонитрилов (предшественников аминокислот) [12].

В первом приближении гликаны можно представить как одежду для белков — куда сподручнее копать огород в комбинезоне, нежели в бальном платье, хотя в нем и не заявишься на светский прием. Но чтобы точнее увидеть, как всё это устроено, необходимо понять, как и чем обусловливается многогранность и разнообразие сахарного декора.

Структурно гликаны представляют собой относительно небольшие полимеры из моносахаридов — самых простых форм сахара и базовых строительных блоков для углеводов. Эти блоки иногда именуют «третьим алфавитом» молекулярной биологии (тогда как первые два — нуклеотиды и аминокислоты). Из пары таких кирпичиков можно составить дисахариды (например, сахарозу или мальтозу), а из большего количества — олиго- или полисахариды. В последние две группы и попадают гликаны, собранные из трех и больше моносахаридов.

Стоит отметить, что «подслащиваться» (то есть модифицироваться гликанами) могут не только белки, но и липиды. Однако в этой статье мы коснемся лишь белкового гликозилирования.

Как и где появляются сахарные модификации?

Гликаны сперва синтезируются в виде предшественника на мембранах эндоплазматического ретикулума и там же ковалентно прикрепляются к строго определенной аминокислотной последовательности уже синтезированного белка. После этого начальный гликоконъюгат переносится в аппарат Гольджи, где гликан может остаться как есть либо претерпеть тримминг — стрижку ненужных сахаридов — с последующей достройкой до новой сахарной структуры. Этим занимается огромное количество ферментов гликозилтрансфераз, которые строго специфичны к тому, какой моносахарид, куда и каким образом они присоединяют [13].

Как именно клетка решает, что за гликан будет построен для конкретного белка, — этого ученые пока не знают наверняка. Но уже известно, что гликаны важны для правильного фолдинга (пространственного сворачивания) белка, а значит, сама зарождающаяся трехмерная структура может диктовать максимально стабилизирующую ее молекулу полисахарида [14]. Помимо этого, на возможность постройки гликана будет влиять доступность исполнителей (ферментов) и материала (набора моносахаридов). Одни лишь эти факторы — достаточно непредсказуемы и зависят от генетического статуса клетки (генотипа и мутаций экспрессии генов), от уровня экспрессии генов и от клеточного гомеостаза в данный момент времени. Всё это взаимосвязано и может регулироваться как внутренними стимулами клетки, так и факторами среды. Такая беспрецедентная пластичность — настоящее испытание для системных биологов и синтетической биологии в целом. Сейчас даже нет исчерпывающих данных обо всех условиях, обеспечивающих появление того или иного гликана, не говоря уже о предсказании и нацеленном синтезе желаемых структур.

Получившиеся гликоконъюгаты либо секретируются наружу, либо остаются связанными с клеточной мембраной и становятся компонентом гликокаликса, формируя структурно-функциональный рельеф клетки (рис. 1). Таким образом, что бы ни приблизилось к клетке, будь то белок, другая клетка или микроорганизм, в первую очередь оно соприкоснется с клеточной «сахарной шубой» [15]. Интересно заметить, что этот рельеф напрямую не закодирован в геноме, однако наследуется дочерними клетками после деления и чрезвычайно важен для правильного их функционирования [7]. Секретируемые же гликоконъюгаты формируют межклеточный матрикс, появление которого считается одним из важных эволюционных шагов к формированию многоклеточности [16]. Матрикс необходим для координированной работы клеток: дифференциации, пространственной локализации, межклеточной коммуникации, передвижения и транспорта. Таким образом, вероятнее всего, гликаны были на передовой эволюции многоклеточности и дальнейшего усложнения организмов, обусловливая необходимую коммуникацию между клетками единого организма.

Рисунок 1. Так гликаны попадают на поверхность клетки и создают ее структурно-функциональный рельеф. В эндоплазматическом ретикулуме происходит синтез предшественника с восемью маннозами, который цепляется к определенной последовательности аминокислот на белке-мишени. Уже вместе они путешествуют через отделы комплекса Гольджи, где гликан может структурно изменяться и редактироваться до финальной формы. Если гликопротеин останется связанным с мембраной, то поучаствует в формировании ландшафта клеточной поверхности. Незаякоренные гликопротеины могут секретироваться в межклеточное пространство, аналогично немодифицированным белкам. Такие ребята в основном займутся постройкой и регуляцией функционирования межклеточного матрикса и клеточных взаимоотношений.

иллюстрация автора статьи

Какими бывают гликаны?

Если гликаны составляют до 90–95% от общей массы белка, они могут быть весьма однообразны — состоять из довольно длинных цепочек чередующихся дисахаридных звеньев, прикрепленных к разным частям белка. Тогда такой гликоконъюгат (белок + полисахарид) будет называться протеогликаном. Большая масса протеогликанов секретируется клетками, составляет межклеточный матрикс и выполняет структурную функцию, например, в составе костей или роговице глаза. Углеводная часть превосходно связывает воду, обеспечивая большую массу и упругость соединительной ткани, и в протеогликанах является основным структурным и функциональным компонентом. Но не стоит забывать, что существенная часть гликокаликса состоит из протеогликанов, выполняющих в основном механическую защитную функцию.

Намного интереснее ситуация, когда гликаны являются меньшей частью гликоконъюгата. Такой вариант молекул называют гликопротеинами. Чаще всего в этом случае мы имеем дело с N- или O-гликозилированием (по обозначению атома присоединения гликанов на белке — азота или кислорода).

Помимо большего набора сахарных «кирпичиков» для постройки, по сравнению с протеогликанами, эти типы гликозилирования еще и характеризуются куда более вариативной системой ветвления и межмоносахаридных связей, а значит, и невероятно бóльшим разнообразием структур (нагляднее — смотрите на рисунке 2).

Рисунок 2. Откуда появляется многообразие гликопротеинов? Разные наборы кирпичиков-сахаридов (чаще более 10 штук) могут быть по-разному собраны в целостные структуры. Варьировать может ветвление антенн гликана, позиция отдельных моносахаридов (особенно фукозы) и тип химической связи между моносахаридами, что обусловливает создание функционально важных изомеров. И не стоит забывать, что на каждой отдельной молекуле белка может быть несколько сайтов гликозилирования (вплоть до сотни и даже больше) с разными гликанами, а разные молекулы того же белка могут нести отличающийся набор гликанов или не быть модифицированы вовсе. Ух! И всё это может меняться со временем под влиянием внешних и внутренних факторов.

иллюстрация автора статьи

Сейчас предполагается, что в человеческом организме существует до 10 000 разных гликанов, что вполне возможно хотя бы с точки зрения комбинаторики и учитывая известные пути биосинтеза гликанов. Принимая во внимание, что на одном белке может быть более сотни сайтов гликозилирования, количество их возможных комбинаций лишь на одной копии одного белка поражает воображение. А также сильно сбавляет энтузиазм ученых-аналитиков, обескураживая сложностью анализа, — пожалуй, это одна из главных причин долгого избегания гликобиологии и ее относительной молодости. Однако скачкообразное развитие методов и приборов для гликоанализа повлекло за собой огромный массив новых исследований — через сахарную призму даже давно изученные функции белков и целых организмов стали выглядеть совсем иначе.

Что гликаны могут делать?

Вы можете спросить: «Неужели структура каждого из них настолько важна для функционирования белка и неужели она так сильно его меняет?» Наиболее правильным ответом будет: «Пока мы еще не знаем». Но далеко не исключено, что так и есть. Примером этому может служить важный для зачатия и вынашивания ребенка белок гликоделин, аминокислотная последовательность которого одинакова и у женщин, и у мужчин, зато разительно различается гликозилирование. У женщин бóльшая часть его гликоформ работает как контрацептив (мешает проникновению сператозоидов в яйцеклетку), тогда как мужской вариант, напротив, стимулирует контакт сперматозоида с яйцеклеткой [17].

Раз уж речь зашла об оплодотворении, нельзя не отметить, насколько ключевым фактором является гликозилирование и в этом процессе [18]. Как таковой, сперматозоид чужероден для женского организма и должен бы запустить иммунную реакцию. Однако он (как и некоторые вирусы!) несет на клеточной мембране белки, модифицированные гликанами с сиаловыми кислотами в составе, что позволяет адаптироваться во враждебной среде. Для сближения с яйцеклеткой эти сахара должны быть убраны — иначе не произойдет оплодотворение. В свою очередь, в защитную оболочку ооцита человека (zona pellucida) встроено четыре гликопротеина. Гликаны на них являются лигандами для рецепторов сперматозоида, инициирующих акросомную реакцию (высвобождение растворяющих эту защитную оболочку ферментов из головки сперматозоида) и, как следствие, проникновение сперматозоида внутрь. В процессе проникновения сперматозоида в яйцеклетке запускается цепочка биохимических процессов, приводящих к отщеплению сахаров от гликопротеинов оболочки яйцеклетки и так называемому «блоку полиспермии» — недопущению проникновения более одного сперматозоида в ооцит. Таким образом, даже самое начало нашей жизни никак не обходится без сахаров.

Совсем недавно на «Биомолекуле» появился постер о тонкостях процесса оплодотворения: «Через тернии к звездам» [19]. А о zona pellucida есть отдельная заметка: «Рецептор для сперматозоида» [20].

В целом, биологические функции гликанов очень сложно классифицировать и обобщить, так как почти вся поверхность любой клетки покрыта разнообразными гликоконъюгатами. А это значит, что любое действие, в котором участвуют эти молекулы, — от оплодотворения до клеточной смерти — будет зависеть от корректного гликозилирования.

Суммируя грубо, гликаны выполняют структурную и запасающую функции (например, гликоген в мышцах и печени и ламинин — важнейший для эмбрионального развития и структуры тканей гликопротеин), функцию молекулярной мимикрии (важную для патогенных и симбиотических организмов, и для ситуации, описанной чуть выше), а также функцию специфических рецепторов для других молекул (чаще всего гликансвязывающих белков, иначе называемых лектинами). Последнее обеспечивает едва ли не все процессы межклеточной коммуникации (а на этом основаны едва ли не все известные биологические функции клеток), их миграцию и взаимодействие в пределах клеточных формаций. Разнообразие уже изученных лектинов довольно велико, и информация о них продолжает пополняться, обогащая наши знания о системной биологии белок-углеводного взаимодействия.

Приведем еще пару примеров поворотной роли гликанов в функционировании белков.

Про агглютинины и наследование групп крови можно прочитать в статье «“Кровавая” работа врачей, ученых и природы» [21].

Рисунок 3. Углеводные детерминанты системы групп крови AB0. Как мы видим, отличия в O-гликанах совсем небольшие, но какой эффект!

иллюстрация автора статьи по Glycans and cells

Если вас интересуют последние новости о пандемии нового коронавируса (не обманывайте, это всех сейчас интересует) — добро пожаловать в регулярно пополняемую рубрику SARS-CoV-2.

Однако стоит упомянуть и о чуть менее радостных новостях — о составе углеводной оболочки нового коронавируса. Чаще всего вирусы выставляют на поверхность гликаны олигоманнозного или высокоманнозного типа, так как эти гликаны появляются первыми в процессе биосинтеза гликанов и их проще наставить по принципу «тяп-ляп» [24], [25]. Наша иммунная система давно научилась быстро реагировать на большие количества манноз на поверхности белков — это зачастую является сигналом чужеродных инфекционных агентов (например бактерий) или патологических процессов внутри клеток (рака, вирусных инфекций). Сайт-специфический анализ гликанов SARS-CoV-2 показал, что этот вирус более предусмотрителен: на поверхности его капсида очень много гликанов так называемого complex type (сложных олигосахаридов) [25], [26]. А это, увы, может означать, что этот коронавирус лучше прячется от нашего иммунного ответа.

Со стороны нашей иммунной системы сахарные модификации тоже играют не последнюю роль. F_c-фрагмент молекул иммуноглобулина G в норме гликозилирован, и эта модификация напрямую влияет на правильность трехмерной структуры и даже на протекание иммунного ответа. Например, наличие или отсутствие всего лишь одного моносахарида (фукозы) в составе углевода на специфичном к патогену иммуноглобулине G может привести либо к запуску цитотоксического Т-клеточного иммунного ответа, либо к активации каскада комплемента и сборке комплекса белков, повреждающего мембрану клетки-мишени (рис. 4) [27]. Обе функции важны для нейтрализации патогена, но в зависимости от протекания иммунного ответа один или другой может быть более предпочтителен.

Рисунок 4. Как себя поведет связанный с антигеном IgG, зависит всего лишь от «маленького красного треугольника» фукозы. Если гликан тяжелой цепи иммуноглобулина G не фукозилирован, то комплекс антиген—антитело провзаимодействует с F_cγ-рецептором на поверхности иммунных клеток и запустит цитотоксический иммунный ответ. Если же гликан фукозилирован, то несколько комплексов антиген—антитело одновременно свяжутся с гексамером из копий белка C1q (субъединиц белка комплемента С1) и запустят классический путь каскада комплемента и образование мембраноатакующего комплекса.

иллюстрация автора статьи по [27]

В последние годы всё быстрее развивается терапевтическое применение биотехнологически синтезированных антител в медицине, особенно широкими шагами идет иммунотерапия онкологических заболеваний. Более подробно про технологию и ее применение можно прочитать в статье «Биотехнология антител» [28]. Раз такое небольшое изменение в углеводной части антитела может привести к весьма драматическим функциональным последствиям, тщательный контроль качества и постоянный мониторинг профиля гликозилирования обязателен для любого биотех-производства. Помимо того, гликозилирование иммуноглобулина G напрямую влияет на период полувыведения из организма и общую стабильность антитела, а значит, общую эффективность и безопасность продукта. Вдобавок, как и любой лекарственный препарат, моноклональные антитела имеют срок действия патента, после истечения которого возможно производство дженериков. В контексте биотех-фармакологии такие препараты чаще называются биосимилярами: в отличие от малых химических молекул их сложно сделать абсолютно идентичными оригиналу по структуре. Но их можно сделать очень сильно похожими на оригинал и подтвердить, что эффективность аналогична. И как вы, наверное, уже догадались, и здесь повторение паттерна гликозилирования важно для получения биомолекулы со сходными с патентом свойствами.

Комбинаторное разнообразие, привнесенное гликанами в структуру строго закодированного в геноме белка, обусловливает важное свойство организма — эпигенетическую адаптируемость, дополнительный уровень усложнения внутренней саморегуляции и взаимодействия с внешней средой. Вдобавок, этот пул новых, постоянно адаптирующихся молекул не привносит изменений в геном, что не только обеспечивает необходимую пластичность организма на «эпипротеомном» уровне, но и более эволюционно полезно, так как не рискует уже упорядоченными в геноме базовыми важнейшими функциями.

Методы изучения гликопротеома

Толщину этой новой главы биологической науки еще сложно достоверно оценить, ведь гликобиология — весьма молодая дисциплина. Интерес к биохимии и метаболизму углеводов возник в первой четверти ХХ века, однако тогда их воспринимали лишь как источник энергии или структурный материал для организма, и не ожидали от них никаких других биологических активностей. Даже в 1970-х — годах взрывного интереса к молекулярной биологии — исследования углеводов катастрофически игнорировались и не поспевали за изучением триады ДНК—РНК—белок. Годами «белковые» и «углеводные» научные сообщества оперировали едва ли не независимо, создавая отдельные архивы гликанов и белков. Мы уже знаем, что углеводные модификации белков могут быть поистине огромными и часто превышать массу самого белкового остова.

Это заставляет задуматься, почему же гликобиология является такой молодой наукой, и как же, добросовестно изучая структуры и функции белков, ученые умудрялись игнорировать гликаны столь долго. По большей части это объясняется структурной сложностью гликомодификаций, которая не вытекает из последовательности геномной ДНК. При имеющихся тогда методах молекулярной биологии расшифровка последовательности углеводных структур была невероятна сложна. Не следует забывать, что на одной клетке могут быть десятки тысяч молекул гликопротеинов, на каждой из них — десятки разных гликанов.

Однако с развитием технологического оснащения (и особенно — методов масс-спектрометрии) гликобиология привлекает всё больший интерес и приобретает всё большее признание.

Так что же за методы используются для изучения гликопротеома?

По аналогии с антителами — рабочими лошадками для избирательной детекции макромолекул в образцах, — мы можем определять углеводы с помощью лектинов — белков, специфически распознающих углеводы или их определенные фрагменты. Лектины и их избирательность во взаимодействии с углеводами являются основой огромного числа молекулярных процессов, протекающих в организме. Однако, если в теории мы можем «натравить» иммунную систему на любой антиген (в том числе и углеводный остаток) и получить специфическое антитело, с лектинами такого не получится: их избирательность уже определена закодированной в геноме структурой. Но ввиду огромного разнообразия лектинов в клетках растений и животных мы почти всегда можем подобрать подходящую для углеводной мишени ловушку. Лектины куда проще и дешевле синтезировать или выделять в больших масштабах.

На рисунке 5 показаны популярные методы, использующие лектины в качестве детектора или наживки [29]. Основой их всех являются принципы сродства двух биологических молекул, благодаря которому мы можем охарактеризовать углеводные структуры в образце, подтвердить наличие нужной углеводной детерминанты или же отфильтровать молекулы с интересующими углеводами в составе для последующего анализа. Последний подход часто используется в подготовке проб для повышения чувствительности и селективности метода.

Рисунок 5. Лектины (гликансвязывающие белки) в молекулярной биологии могут быть как инструментом, так и целью эксперимента. Понимание работы лектинов очень важно для функциональной гликобиологии, стремящейся расшифровать устройство «сахарного кода» на поверхности клеток. Но они же являются очень специфичным инструментом для детекции и обогащения молекул с определенными гликомодификаторами.

Как пример рассмотрим подход к поиску новых онкологических биомаркеров в сыворотке крови. Подавляющее большинство известных сегодня циркулирующих онкомаркеров (например, раковый эмбриональный антиген (РЭА) или альфа-фетопротеин (АФП)) попадают в кровь после секреции раковыми или окружающими их клетками и по структуре являются гликопротеинами, и ученым было бы интересно обогатить именно эту фракцию [30]. Для этих целей можно использовать препаративную афинную хроматографию, где панель иммобилизованных лектинов будет улавливать все гликопротеины в составе образца.

Давайте представим себе, что мы хотим проанализировать отдельно взятый образец гликопротеина с несколькими сайтами N-гликозилирования. Мы помним, что из-за нешаблонной сборки, на отдельно взятой молекуле этого белка могут быть несколько разные гликаны на каждом единичном сайте. А также мы помним, что сама структура каждого гликана может быть очень важна. Какие методы могут охарактеризовать каждый аспект этой проблемы (рис. 6)?

Рисунок 6. Три уровня анализа гликопротеинов: анализируем глубже, точнее и шире

иллюстрация автора статьи

Для начала мы можем оценить, какие гликаны вообще присутствуют в этом образце белка. Для этого мы отсоединим все углеводные модификации от белкового скелета. Это можно сделать с помощью бактериального фермента N-гликозидазы F либо в результате химических реакций, разрушающих белковый остов, но оставляющих сахара нетронутыми. Первый метод используется для получения N-связанных гликанов, второй — чаще для О-гликанов.

После очистки и концентрирования полученных сахаров, нам нужно понять, как установить их состав и структуру.

Стоит отметить, что вероятность наличия в полученном образце более чем одного гликана стремится к единице. Даже если наш белок содержит лишь один сайт гликозилирования, каждая копия этого белка может нести несколько иной вариант гликомодификации. Такой феномен называется микрогетерогенностью гликозилирования и является прямым следствием не шаблонной, но ферментативной сборки углеводного полимера. А раз в нашем образце находится не одна молекула, а несколько, необходимо их как-то разделить и уже затем по очереди отправлять в анализатор или детектор.

Для большинства задач биоаналитической химии, требующих высокой производительности, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [31] остается самым популярным методом разделения сложных образцов, и гликаны не оказались исключением. ВЭЖХ не только позволяет существенно сократить время одного разделения (вплоть до 5–10 минут!), но и обеспечивает высокую воспроизводимость и повторяемость результатов. Последнее очень важно в том случае, если идентификация гликанов происходит путем сравнения скорости их схода с колонки с набором стандартов. Тогда детекторы — UV-детектор или флуоресцентный — входят в состав системы разделения и регистрируют сигнал схода с колонки. Так как гликаны сами по себе не поглощают ультрафиолет и не флуоресцируют, перед хроматографией необходимо модифицировать стандарты и экспериментальные образцы подходящей меткой.

Другой вариант детекции — это масс-спектрометр [32]. Он зачастую не требует химической модификации образцов и по сути своей функционирует как очень точные молекулярные весы, способные определить массу и состав молекулы. Вдобавок к этому, тандемная масс-спектрометрия может позволить узнать структуру исследуемого гликана. В этом подходе мы сперва определяем молекулярную массу целой молекулы, затем дробим ее на части и (в тандеме с первым измерением) узнаём массу осколков. После чего с помощью компьютерных программ (а иногда даже вручную) собираем полученный паззл и определяем пространственную структуру углеводного полимера. До повсеместного распространения масс-спектрометров и точных аналитических стандартов сахаров эта же задача установления первичной структуры решалась биохимическими методами. Экзогликозидазы — ферменты, специфически отщепляющие определенные моносахариды с конца гликана, — последовательно добавляли к одному и тому же образцу смеси гликанов. Дальше хроматографический анализ проводили после каждой реакции, оценивали изменения во времени миграции и интенсивности сигнала. Идеология такого подхода очень напоминает метод белкового секвенирования по Эдману [32].

ЗАО «БиоХимМак» — спонсор спецпроекта по гликобиологии

Рисунок 7. Анализ N-гликанов: от высокоскоростного скрининга до углубленного научного исследования

иллюстрация автора статьи

«БиоХимМак» — официальный дистрибьютер компании Agilent, поставляющий инструменты и реагенты для высокоскоростного анализа гликозилирования белков. Эти технологии могут успешно применяться как для решения исследовательских задач, так и для рутинного контроля качества биотерапевтических препаратов на технологическом производстве. Гликозилирование — это критическая характеристика качества и свойств гликопротеинов (например, терапевтических антител, гликоконъюгатов). Важно как поддерживать стабильность гликомодификаций биопрепарата в производстве, так и обеспечить соответствие гликопрофиля разрабатываемого биосимиляра оригинальному патентному продукту.

«БиоХимМак» предлагает широкий спектр продуктов для всех этапов анализа свободных гликанов:

Материал предоставлен партнёром — компанией «БиоХимМак»

Однако не только ВЭЖХ может использоваться как метод разделения. Очень популярным и эффективным методом для анализа гликанов оказался капиллярный электрофорез (КЭ). Изначально метод завоевал популярность среди исследователей ДНК и РНК, и лишь потом ученые осознали, что им можно делить что угодно, практически любые молекулы. В системе КЭ соединения мигрируют в зависимости от их электрофоретической мобильности, которая зависит от размера и заряда молекулы. КЭ — очень простая система, по сути своей — очень тонкая трубка с буфером, к концам которой прикладывается электрический потенциал (рис. 8). Детекция после разделения в системе КЭ может осуществляться теми же методами, что и в ВЭЖХ: UV- и флуоресцентным детекторами и (тандемной) масс-спектрометрией [31].

Рисунок 8. Схема устройства системы капиллярного электрофореза и процесса разделения в ней гликанов. Скорость миграции зависит от их заряда и размера (электрофоретической подвижности), а также от скорости движения окружающего их буферного раствора (электроосмотического потока).

иллюстрация автора статьи по [31]

Оба предыдущих варианта анализа подходят и для следующего уровня разбора нашего гипотетического гликопротеина — сайт-специфического картирования гликанов. В этом варианте мы оставляем гликаны прикрепленными к пептидному остову, но обрабатываем белок специфической протеазой, например, трипсином. В результате применения этого стандартного для протеомики [32] метода получится смесь пептидов и гликопептидов, которую мы можем анализировать тем же способом, что и свободные гликаны: разделением и детекцией. Однако в этом случае оптимальным детектором все же станет масс-спектрометр. Во-первых, гликопептидных стандартов для расчета времени миграции обычно не производят. Во-вторых, тандемная масс-спектрометрия может одномоментно понять структурный состав гликана и последовательность несущего его пептида.

Такой подход имеет несколько преимуществ перед простой оценкой набора углеводных модификаций. Во-первых, если белок имеет больше одного предполагаемого сайта гликозилирования, мы можем узнать, какие именно гликаны находятся в той или иной части молекулы. Во-вторых, если в образце больше одного гликопротеина или мы не уверены в качестве очистки препарата, это сразу станет очевидно по пептидному остову.

Третий уровень анализа — самый крупный, простой и в то же время безумный. А что если мы просто возьмем наш гликопротеин, ничего с ним делать не будем и сразу отправим в хроматограф? При достаточной мощности разделения и очень высоком разрешении масс-спектрометра такой подход может сработать и показать сразу всё множество гликоформ нашего гликопротеина. Попытки так называемого анализа интактного (полноразмерного) белка начали всё чаще встречаться в публикациях, шагая рука об руку с инструментальным и вычислительным прогрессом. Однако до сих пор самыми успешными выходят лишь попытки проанализировать сравнительно небольшие белки с одним, максимум двумя сайтами гликозилирования.

Также важным аспектом в анализе гликозилирования становится внедрение высокопроизводительных методов анализа. Гликомика — широкомасштабное изучение всех гликанов в биологической системе или целом организме — ввиду ее сложности по праву является такой же «-омикой», как и геномика, метаболомика и протеомика [33]. Аналогично белковому фингерпринту, биологическая система может иметь и углеводный отпечаток. Этот тип данных активно используется для понимания системных биологических процессов и для поиска биомаркеров различных состояний организма (в том числе и патологических). Получение такого фингерпринта возможно как с помощью высокоавтоматизированных версий уже описанных вариантов анализа свободных гликанов всей системы (отдельной единичной клетки, ткани, плазмы крови), так и с использованием MALDI масс-спектрометрии. В этом случае после отщепления углеводов их отправляют в масс-спектрометр без предварительного разделения, таким образом получая не точный профиль, но относительно густонаселенный отпечаток масс содержащихся в образце гликанов. По их точной массе можно предположить их моносахаридный состав, но главное, как и в случае протеомики, их можно легко и быстро сравнить между собой.

Все методы, упомянутые выше, относятся к структурному анализу гликанов и гликопротеинов, скорее служащим для охвата разнообразия и накопления данных о составе гликомодификаций белков различных организмов. Однако для построения сколь-либо однозначных заключений об организации, механизмах и ролях компонентов системы гликозилирования необходимы классические функциональные гликомные и гликобиологические исследования — об информации, зашифрованной в гликоме организма, и о том, как и при каких условиях ее считывают и расшифровывают гликансвязывающие белки — лектины, — передавая сигнал дальше. Пока гликопротеомика становится на ноги, наращивая технологические мощности, функциональной гликомике предстоит еще подрасти и перевернуть системную биологию и наше понимание функционирования клеток.

Заключение

Подводя итоги, хотелось бы вернуться в самое начало статьи и поставить на нем акцент. Пускай гликобиология молодая, сложная и часто незаслуженно игнорируемая генетиками и другими учеными наука, не стоит повторять ошибку исследователей ХХ века и воспринимать углеводы лишь как энергоемкий компонент еды. Потенциал гликобиологии и гликомики в объяснении работы иммунитета, взаимодействия с ним патогенов, клеточного сигналинга и коммуникации, эмбрионального развития и онтогенеза, в синтетической биологии и исследованиях биомаркеров настолько огромен и далек, что пока сложно оценить его реальные масштабы, но не замечать уже невозможно. Поэтому в следующей статье цикла мы поговорим про гликобиологию, всё выше поднимающую голову в аспекте медицины. Почему именно углеводы могут сказать новое слово в биотехе и здоровье организма? Почему белок не может прийти в организм голым, и почему нам не хватает белков, РНК и малых молекул? Об этом — в следующий раз.

Источник