что такое генная клеточная инженерия

3.9. Биотехнология, клеточная и генная инженерия, клонирование.

— это производство необходимых человеку продуктов и материалов с помощью живых организмов, культивируемых клеток и биологических процессов.

Возможности биотехнологии необычайно велики благодаря тому, что ее методы выгоднее обычных: они используются при оптимальных условиях (температуре и давлении), более производительны, экологически чисты и не требуют химических реактивов, отравляющих среду и др.

Объекты биотехнологии: многочисленные представители групп живых организмов — микроорганизмы (вирусы, бактерии, протисты, дрожжи и др.>, растения, животные, а также изолированные из них клетки и субклеточные структуры (органеллы). Биотехнология базируется на протекающих в живых системах физиолого-биохимических процессах, в результате которых осуществляются выделение энергии, синтез и расщепление продуктов метаболизма, формирование химических и структурных компонентов клетки.

Главные направления биотехнологии:

1) производство с помощью микроорганизмов и культивируемых эукариотических клеток биологически активных соединений (ферментов, витаминов, гормональных препаратов), лекарственных препаратов (антибиотиков, вакцин, сывороток, высокоспецифичных антител и др.), а также белков, аминокислот, используемых в качестве кормовых добавок;

2) применение биологических методов борьбы с загрязнением окружающей среды (биологическая очистка сточных вод, загрязнений почвы и т. и.) и для защиты растений от вредителей и болезней;

3) создание новых полезных штаммов микроорганизмов, сортов растений, пород животных и т. п.

Задачи, методы и достижения биотехнологии.

Человечеству необходимо научиться эффективно изменять наследственную природу живых организмов, чтобы обеспечить себя доброкачественной пищей и сырьем и при этом не привести планету к экологической катастрофе. Поэтому не случайно главной задачей селекционеров в наше время стало решение проблемы создания новых форм растений, животных и микроорганизмов, хорошо приспособленных к индустриальным способам производства, устойчиво переносящих неблагоприятные условия, эффективно использующих солнечную энергию и, что особенно важно, позволяющих получать биологически чистую продукцию без чрезмерного загрязнения окружающей среды. Принципиально новыми подходами к решению этой фундаментальной проблемы является использование в селекции генной и клеточной инженерии.

Генная (генетическая) инженерия —

раздел молекулярной генетики, связанный с целенаправленным созданием новых молекул ДНК, способных размножаться в клетке-хозяине и осуществлять контроль за синтезом необходимых метаболитов клетки.

Возникнув на стыке химии нуклеиновых кислот и генетики микроорганизмов, генная инженерия занимается расшифровкой структуры генов, их синтезом и клонированием, вставкой выделенных из клеток живых организмов или вновь синтезированных генов в клетки растений и животных с целью направленного изменения их наследственных свойств.

Для осуществления переноса генов (или трансгенеза) от одного вида организмов в другой, часто очень далекий по своему происхождению, необходимо выполнить несколько сложных операций:

выделение генов (отдельных фрагментов ДНК) из клеток бактерий, растений или животных. В отдельных случаях эту операцию заменяют искусственным синтезом нужных генов;

соединение (сшивание) отдельных фрагментов ДНК любого происхождения в единую молекулу в составе плазмиды;

введение гибридной плазмидной ДНК, содержащей нужный ген, в клетки хозяина;

копирование (клонирование) этого гена в новом хозяине с обеспечением его работы.

Клонированные гены путем микроинъекции вводят в яйцеклетку млекопитающих или протопласты растений (изолированные клетки, лишенные клеточной стенки) и из них выращивают целых животных или растения, в геном которых встроены (интегрированы) клонированные гены. Растения и животные, геном которых изменен путем генноинженерных операций, получили название трансгенных растений или трансгенных животных.

Уже получены трансгенные мыши, кролики, свиньи, овцы, в геноме которых работают чужеродные гены различного происхождения, в том числе гены бактерий, дрожжей, млекопитающих, человека, а также трансгенные растения с генами других, неродственных видов. Трансгенные организмы свидетельствуют о больших возможностях генной инженерии как прикладной ветви молекулярной генетики (например, получено новое поколение трансгенных растений, для которых характерны такие ценные признаки, как устойчивость к гербицидам, к насекомым и др.).

На сегодняшний день методы генной инженерии позволили осуществить синтез в промышленных количествах таких гормонов, как инсулин, интерферон и соматотропин (гормон роста), которые необходимы для лечения ряда генетических болезней человека — сахарного диабета, некоторых видов злокачественных образований, карликовости,

С помощью генетических методов были получены также штаммы микроогранизмов (Ashbya gossypii, Pseudomonas denitrificans и др.), которые производят в десятки тысяч раз больше витаминов (С, В₃, В₁₃, и др.), чем исходные формы.

Клеточная инженерия —

совокупность методов, используемых для конструирования новых клеток. Включает культивирование и клонирование клеток на специально подобранных средах, гибридизацию клеток, пересадку клеточных ядер и другие микрохирургические операции по «разборке» и «сборке» (реконструкции) жизнеспособных клеток из отдельных фрагментов.

В основе клеточной инженерии лежит использование методов культивирования изолированных клеток и тканей на искусственной питательной среде в регулируемых условиях. Это стало возможным благодаря способности растительных клеток в результате регенерации формировать целое растение из единичной клетки. Условия регенерации разработаны для многих культурных растений — картофеля, пшеницы, ячменя, кукурузы, томатов и др. Работа с этими объектами делает возможным использование в селекции нетрадиционных методов клеточной инженерии — соматической гибридизации, гаплоидии, клеточной селекции, преодоления нескрещиваемости в культуре и др.

Клонирование —

метод получения нескольких идентичных организмов путем бесполого (в том числе вегетативного) размножения. Таким способом на протяжении миллионов лет размножаются в природе многие виды растений и животных. Однако сейчас термин «клонирование» обычно используется в более узком смысле и означает копирование клеток, генов, антител и даже многоклеточных организмов в лабораторных условиях. Появившиеся в результате бесполого размножения экземпляры по определению генетически одинаковы, однако и у них можно наблюдать наследственную изменчивость, обусловленную случайными мутациями или создаваемую искусственно лабораторными методами.

Тематические задания

А1. Производством лекарств, гормонов и других биологических веществ занимается такое направление, как

1) генная инженерия

2) биотехнологическое производство

3) сельскохозяйственная промышленность

А2. В каком случае метод культуры тканей окажется наиболее полезным?

1) при получении гибрида яблони и груши

2) при выведении чистых линий гладкосемянного гороха

3) при необходимости пересадить кожу человеку при ожоге

4) при получении полиплоидных форм капусты и редьки

А3. Для того чтобы искусственно получать человеческий инсулин методами генной инженерии в промышленных масштабах, необходимо

1) ввести ген, отвечающий за синтез инсулина в бактерии, которые начнут синтезировать человеческий инсулин

2) ввести бактериальный инсулин в организм человека

3) искусственно синтезировать инсулин в биохимической лаборатории

4) выращивать культуру клеток поджелудочной железы человека, отвечающей за синтез инсулина.

Источник

Медицина и генная инженерия: достижения и проблемы (на пересечении биологии, медицины и биоэтики)

Генная инженерия представляет собой новое направление в сфере молекулярной биологии, которое получило широкое распространение во многих сферах медицины и биологии относительно недавно.

Генная инженерия позволяет целенаправленно, по заранее намеченной программе, экспериментально модифицировать геном с использованием генетической информации из разных гетерологических систем: вирусов, бактерий, насекомых, животных и человека. Применяя методы генной инженерии, ученые способны модифицировать структуру генов, а также создавать гибридные гены.

Следует отметить огромный вклад генной инженерии в улучшение сферы медицинского обслуживания. Так, благодаря генной инженерии стало возможным создание новых диагностических препаратов, вакцин и препаратов для заместительной терапии, а также лечение наследственных заболеваний. Применение генной терапии в лечении такой патологии как первичные иммунодефициты является единственным терапевтическим методом, обеспечивающим полное излечение, что значительно улучшает качество жизни пациентов и снижает риск летального исхода. В последнее время рассматриваются новые варианты применения генной инженерии в трансплантологии и редактировании генома эмбрионов. Возможность применения этой инновационной технологии порождает множество биоэтических вопросов. Считаю, что анализ предполагаемых последствий применения генной инженерии для общества должен создавать рамки возможного вмешательства в геном организмов.

Среди многих достижений генной инженерии, получивших применение в медицине, наиболее значимое — получение человеческого инсулина в промышленных масштабах. Генные инженеры в качестве первой практической задачи решили клонировать ген инсулина. Клонированные гены человеческого инсулина были введены с плазмидой в бактериальную клетку, где начался синтез гормона, который природные микробные штаммы никогда не синтезировали.

Использование генно-инженерного инсулина не вызывало каких-либо патологических реакций в организме, в том числе и иммунопатологических, которые часто наблюдались у пациентов, использующих в терапии диабета инсулин животного происхождения. Масштабное использование генно-инженерного инсулина значительно снизило летальность от диабета, в особенности у пациентов детского возраста, так как именно у этой категории населения преимущественно развивается инсулинозависимый диабет 1 типа. Следующими разрабатываемыми генно-инженерными препаратами были интерфероны и интерлейкины, используемые в терапии вирусных и онкологических заболеваний.

Около 200 новых диагностических препаратов уже введены в медицинскую практику, и более 100 генно-инженерных лекарственных веществ находятся на стадии клинических исследований. Среди них лекарства, используемые в терапии артрозов, сердечно-сосудистых заболеваний, онкологических заболеваний.

Сферы использования генной инженерии в медицине значительно расширяются. Так актуальной является возможность применения генной инженерии в диагностике и терапии наследственных заболеваний.

В настоящее время известно более 4000 наследственных заболеваний, для большинства из которых не найдено эффективных способов лечения. Генные инженеры разрабатывают диагностические препараты, позволяющие обнаруживать генетические аномалии в период беременности, что дает возможность предотвратить рождение ребенка с генетической аномалией [4].

Генная терапия наследственных заболеваний заключается в замене мутантных генов на гены «дикого типа», в которых отсутствуют мутации.

Так в 1989 году в Национальных Институтах Здоровья США впервые была предпринята попытка применить в клинической практике генную терапию для лечения пациентов с диагнозом тяжелая комбинированная иммунная недостаточность (ТКИН). Наиболее обнадеживающие результаты ожидают в тех случаях, когда заболевание обусловлено дефектом одного гена. В этом случае полагают, что удастся вводить нормальный ген в соматические клетки прицельно в то место на хромосоме, где находится дефектный ген. При гомологичной рекомбинации введенный ген заместит дефектный. Такой однократной процедуры в ряде случаев будет достаточно, чтобы излечить болезнь. Однако на практике очень трудно проконтролировать судьбу введенной в клетки ДНК, и на одно правильное встраивание в геном приходится более 1000 случайных. Разрабатывается и другой подход, когда введенный ген не заменяет дефектный, а компенсирует его функцию, встраиваясь в хромосому в другом месте.

Инновационной технологией в редактировании генома является технология CRISPR. По причине легкости редактирования генома с использованием технологии CRISPR существует значительный интерес к перспективам редактирования генома эмбриона человека.

Основной метод применения технологии CRISPR — доставка редактирующих агентов в клетки эмбриона, созданного путем оплодотворения in vitro. В последствии может оказаться более целесообразным и этически приемлемым редактировать гаметогенные клетки-предшественники у будущих родителей. Преимущество зародышевой коррекции аллелей генов, соответствующих патологическим состояниям, заключается в том, что они навсегда исчезнут из генома.

Еще одной сферой использования генной инженерии в медицине является CAR-T-терапия. На сегодняшний день одним из наиболее перспективных направлений в терапии онкологических заболеваний является адоптивная клеточная иммунотерапия. При проведении такой терапии выделяют, активируют и размножают аутологичные T-лимфоциты, а затем вводят их обратно пациенту, что приводит к частичной регрессии или эрадикации опухоли. Введение Т-клеток, модифицированных химерными антигенными рецепторами (CAR-T-клеток), является одним из наиболее активно развивающихся направлений иммуноонкологии [6]. CAR-T-клетки представляют собой генетически модифицированные собственные Т-клетки пациентов, которые содержат химерный антигенный рецептор. Этот рецептор содержит в себе часть антитела, специфического к антигену опухоли и часть, рецептора Т-клеток. С использованием CAR-T-терапии получены обнадеживающие результаты при гематологических опухолевых заболеваниях. Так, клинические испытания CAR-T-клеток, направленных против В-лимфоцитарного антигена CD19, показали их эффективность при лечении резистентных к химиотерапии опухолей В-клеточного происхождения.

Биоэтические проблемы

С точки зрения биоэтики возникает ряд вопросов о допустимости применения генной инженерии по отношению к человеку. Помимо биоэтических проблем существует ряд дополнительных вопросов как в непосредственно самой процедуре генетической модификации клеток организма человека, так и в отдаленных последствиях этой процедуры для отдельного человека и для человеческой популяции в целом.

Примером проблемы при использовании генной инженерии в редактировании генома эмбриона является риск того, что попытка исправить генетический код не родившегося ребенка может принести больше вреда, чем пользы. Современная технология редактирования генома не обладает достаточной эффективностью и специфичностью, чтобы полностью гарантировать безопасность. Мутации, возникающие в нецелевых локусах хромосом вследствие введения редактирующих конструкций, могут влиять на организм ребенка и передаваться из поколения в поколение, а их эффекты не всегда могут быть доброкачественными, предсказуемыми или обратимыми.

Использование генной терапии в лечении наследственных заболеваний также сопровождается рядом проблем, так при лечении некоторых заболеваний отдаленным последствием такой терапии является развитие онкологических заболеваний.

Обратной стороной CAR-T-терапии является высокий риск возникновения системных и опасных для жизни побочных эффектов, в первую очередь, гиперцитокинемии (цитокиновый шторм, цитокиновый каскад, синдром выброса цитокинов и синдром лизиса опухоли). Эти осложнения могут спровоцировать развитие синдрома полиорганной недостаточности и, как следствие, привести к летальному исходу. Еще одна существенная проблема применения CAR-T-терапии – неспецифическая цитотоксичность, особенно актуальная в случае терапии солидных опухолей, к которым крайне сложно подобрать специфичные антигены. Неспецифическая цитотоксичность обусловлена развитием интенсивной и быстрой кросс-реакции введенных Т-клеток на здоровые клетки, что часто приводит к летальному исходу.

Ценностные суждения из области биоэтики можно подразделить на два типа, как это делает М. Хяурю в своей работе «Категорические возражения генной инженерии − критика». Суждения первого типа касаются вероятных последствий тех или иных биотехнологических процедур, их можно назвать прагматическими (или консеквенционалистскими). Суждения второго типа высказываются вне зависимости от возможных последствий предмета суждений, их называют деонтологическими (или категорическими).

Примером этических суждений о конкретных последствиях может служить то, что граница между лечением и улучшением в области медицинской генетики не является очевидной, и улучшающая генная инженерия сама по себе может быть благом, но угрозу представляет социальное неравенство относительно распределения выгод генной инженерии так как это может привести к созданию серьезной и необратимой несправедливости. Любые генно-инженерные процедуры будут доступны в первую очередь для развитых стран, в то время как страны третьего мира будут лишены возможности использования генно-инженерных технологий.

Отдельные генетические последовательности, пригодные для улучшающей генной инженерии людей, в будущем могут быть запатентованы. Рынок улучшающей генной инженерии представляется перспективным: все люди будут заинтересованы в улучшении параметров своего потомства, но, иметь доступ к таким процедурам в первую очередь будут жители развитых стран.

Использование генной инженерии приведет не только к усугублению неравенства между жителями отдельных стран, но и к расслоению общества внутри этих стран. Генетически привилегированные люди могут стать не стареющими, здоровыми супер гениями безупречной физической красоты, отличающимися блестящим остроумием и обезоруживающим, умаляющим чувство собственного достоинства юмором, излучающими тепло, эмпатический шарм и ослабленную непоколебимость. Непривилегированные останутся сегодняшними людьми, возможно, не имеющими чувства самоуважения и страдающими от случайных приступов зависти. Мобильность между низшими и высшими классами может исчезнуть, и ребенок, рожденный в бедной семье, не имеющий генетического усовершенствования, не сможет успешно соперничать с супер детьми богатых родителей. Даже если не случится дискриминация или эксплуатация низшего класса, все еще будет что-то разрушительное в перспективе общества с такими крайними формами неравенства.

Примерами категорических суждений являются изменение уникальности и ценности личности человека, подвергшегося воздействию генной инженерии, а также дискриминация по отношению к еще не родившемуся ребенку, в случае проведения генно-инженерных процедур на зародышевой линии.

В случае участия в создании «дизайнерских детей», ученый принимает (в соответствии с собственными предпочтениями и/или общественными стереотипами) необратимые решения, задающие основания и границы органических черт будущего индивида, а вместе с тем и черт будущей личности. Из этого следует, что генетически запрограммированные личности уже более не смогут рассматривать себя как безусловных творцов своей собственной истории жизни. Это может повлечь за собой множество самых неожиданных последствий, включая расщепление идентичности, изменение механизмов, формирующих самосознание, самопонимание, самооценку, а значит и существенный сдвиг морально-нравственных норм, ценностей и идеалов. Необходимо отдавать себе отчет в том, что реализация возможностей генетической инженерии приводит к угрозе трансформации не только человеческой телесности (которая является результатом биологической эволюции, насчитывающей миллионы лет), но и собственно человеческой культуры, ее эмоционального строя, черт личности, особенности индивидуального сознания, духовного мира, способов переживания бытия, а также характера самоидентификации личности..

Присвоив себе роль творцов, человечество начинает переделывать природу, исходя исключительно из своей выгоды и не считаясь с балансом, тем самым нарушая всю структуру природных механизмов. Новаторские методы породили дилеммы, несущие в себе вызов моральным ценностям. Здесь важно обратить внимание на то чрезвычайно негативное обстоятельство, что достижения генетики и биомедицины, делая геном человека объектом постороннего вмешательства, катализируют не только возрастание значимости человеческой жизни, но и её падение. Как это ни парадоксально, но девальвация ценности жизни проявляет себя особенно ярко в технологиях, обеспечивающих воспроизводство человеческой жизни. Создание «запасных» зигот и их последующее уничтожение — условие процедуры искусственного оплодотворения. Негативные результаты пренатальной диагностики — повод для искусственного прерывания жизни. Существует реальный риск овеществления эмбриона, а значит, и выросшего из него человека. Человек здесь выступает как творец, проявляя тем самым свою универсальность. Впервые в истории живое становится объектом проектирования и конструирования; тем самым нивелируется различие между живым и неживым как объектами познания и преобразования. Безусловно, такого рода практическая деятельность должна быть ограничена определенными рамками и запретами. Однако до какой степени подобные исследования совместимы с природой и свободой человека? До какого предела следует разрешать экспериментальную интервенцию в человеческий организм, чтобы не нанести непоправимый ущерб человеческому достоинству, уникальности и неповторимости каждого индивида? [19].

В воспроизводстве наиболее важными вопросами являются интересы ребенка, который не может дать свое предварительное согласие или свободно вступать в любую форму договора. Ведь эмбрион является будущей личностью, которая не давала разрешения на проведение опытов.

Также следует отметить, что способность отбирать гены детей и создавать так называемых «дизайнерских детей» будет изменять родителей, которые будут рассматривать своих детей как обычный продукт. Тогда люди начнут оценивать потомство в соответствии со стандартами контроля качества, и это отрицательно повлияет на этический идеал безоговорочного принятия детей, не важно, каковы их способности и индивидуальные черты.

Еще одним вопросом является то, что сегодня никто не может даже приблизительно оценить те последствия, которые повлечет за собой размножение живой материи, созданной искусственно.

Также хочется осветить биоэтические вопросы генетического тестирования. Наиболее глубокие проблемы, относящиеся к прогнозированию, лежат в сфере здравоохранения, где проводится генетическое тестирование. Генные технологии имеют отношение к правам человека и в судебных случаях — например, при установлении отцовства или материнства и при идентификации подозреваемых преступников. Права человека нарушаются и тогда, когда насильственное или даже добровольное тестирование методами генной технологии может представлять угрозу частной жизни индивида, если информация помещается в общедоступную базу данных. Нарушение прав человека в данном случае состоит в том, что подозреваемым становится любой, кто отказывается подвергнуться ДНК-тестированию.

Двигаться вперед или остановиться? Предлагаем поразмышлять….

Автор — Валерия Пугачева

Лещинская, И. Б. Генетическая инженерия / И. Б. Лещинская // Соросовский образовательный журнал. – 1996. – № 1. – С. 32-394.

Мохов, А. А. Использование технологии геномного редактирования: достижения и перспективы / А. А. Мохов, А. А. Чапленко, А. Н. Яворский // Биомедицина. – 2019. – Т. 15, № 2. – С. 34-42.

Молекулярные подходы к безопасной и контролируемой Т-клеточной терапии / Р. С. Калинин [и др.] // Acta Naturae. – 2018. – Т. 10, № 2. – С. 17-25.

Буйнякова, И. С. «Дизайнерские младенцы» социально-этические проблемы биотехнологического проектирования будущих детей / И. С. Буйнякова // Научные ведомости. – 2017. – Т. 40, № 9. – С. 130-139.

Воронцова, З. И. Философские и социокультурные проблемы биогенных технологий / З. И. Воронцова // Новые технологии. – 2009. – № 4. – С. 13-19.

Найдыш, В. М. Философские проблемы антропогенетики генной инженерии (статья вторая) / В. М. Найдыш, Е. Н. Гнатик // Вестник РУДН. – 2009. – № 3. – С. 31-38.

Воронцов, С. А. Морально-этические проблемы развития биотехнологии / С. А. Воронцов // Вестник молодежной науки. – 2017. – Т. 5, № 12. – С. 22-27.

International Union of Immunological Societies: 2017 Primary Immunodeficiency Diseases Committee Report on Inborn Errors of Immunity / C. Picard [et al.] // J. Clin. Immunol. – 2018. – Vol. 38, N 1. – P. 96-128.

Первичные иммунодефициты: принципы терапии и организации медицинской помощи / Н. Chapel [et al] // Frontiers in Immunology. – 2014. – Т. 5, № 12. – С. 1-15.

Источник

ГК «Униконс»

Продвижение и реализация комплексных пищевых добавок, антисептиков и др. продукции.

«Антисептики Септоцил»

Септоцил. Бытовая химия, антисептики.

«Петритест»

Микробиологические экспресс-тесты. Первые результаты уже через 4 часа.

«АльтерСтарт»

Закваски, стартовые культуры. Изготовление любых заквасок для любых целей.

1.3. КЛЕТОЧНАЯ И ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Современная биотехнология включает ряд высоких технологий, которые базируются на последних достижениях экологии, генетики, микробиологии, цитологии, молекулярной биологии. В современной биотехнологии используются биологические системы всех уровней: от молекулярно-генетического до биогеоценотического (биосферного); при этом создаются принципиально новые биологические системы, не встречающиеся в природе. Биологические системы, используемые в биотехнологии, вместе с небиологическими компонентами (технологическое оборудование, материалы, системы энергоснабжения, контроля и управления) удобно называть рабочими системами.

К основным разделам современной биотехнологии относятся: микробиологический синтез, клеточная инженерия и генная инженерия.

Используя методы генной и клеточной инженерии, современная биотехнология осуществляет широкое конструирование генетически модифицированных организмов (ГМО), в том числе микроорганизмов, растений и животных.

Целый ряд ГМО используется в неконтролируемых условиях (в сельском хозяйстве, рыбоводстве, для биологической борьбы с вредителями сельского и лесного хозяйства и т. д.).

Однако перед генной инженерией стоит ряд этических и технологических проблем. Например, при выпуске ГМО в окружающую среду они могут взаимодействовать с разнообразными организмами, сообществами и экосистемами конкретных территорий. При этом процесс и исход таких взаимодействий не всегда поддается прогнозированию.

В результате возникает проблема генетической безопасности как отдельных популяций человека, растений и животных, так и экосистем в целом. В частности, существует опасность внедрения трансгенов («искусственных генов») в геном неконтролируемых организмов в результате скрещивания и/или рекомбинации ГМО и «диких» форм.

Многие ученые и организации возражают против создания генетически модифицированных организмов, поскольку при этом возможны непредсказуемые последствия. Поэтому развитые страны должны принять нормативные акты, регулирующие создание, испытание и использование ГМО, включающее выпуск в окружающую среду.

1.3.1. КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ: ДОСТИЖЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ

Клеточная инженерия — это один из основных разделов современной биотехнологии, основанный на выделении и культивировании тканей и клеток высших многоклеточных организмов.

Культивирование тканей и клеток происходит вне организма— in vitro («в пробирке, в колбе, в стеклянной посуде»), в специально подобранных условиях.

КЛЕТОЧНО-ТКАНЕВЫЕ КУЛЬТУРЫ РАСТЕНИЙ

Основным типом культивируемой растительной клетки является каллусная — это наименее дифференцированная ткань, которая в обычных условиях возникает при повреждениях и функционирует непродолжительное время. Каллус получают из паренхимы корнеплодов, стеблей, листьев, а также из гаплоидных тканей пыльников. Культивирование клеток растений производят или поверхностным способом, или в жидкой питательной среде. В любом случае необходимо подобрать определенное соотношение компонентов питательной среды. В состав питательной среды обязательно входят: углеводы (сахароза или глюкоза), минеральные соли, витамины, регуляторы роста и развития (определенные фитогормоны); иногда добавляют дрожжевой экстракт или растительные экстракты. Поддерживается определенная температуры, кислотность, газовый состав.

КЛЕТОЧНО-ТКАНЕВЫЕ КУЛЬТУРЫ ЖИВОТНЫХ

Основным типом культивируемой животной клетки являются опухолевые клетки «шеломы или саркомы (раковые клетки). В то же время культивированию поддаются и другие типы клеток: клетки селезенки, фибробласты соединительной ткани, гепатоциты печени, лимфоциты и т. д. Культуры опухолевых клеток практически бессмертны, они переносят неограниченное количество пассажей (пересевов на свежую питательную среду); длительность существования культур других тканей ограничена. Простейшей питательной средой для животных клеток служит сыворотка крови, но в ряде случаев используются полусинтетические и синтетические среды.

СОМАТИЧЕСКАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ. ГИБРИДОМЫ

Методы клеточной инженерии позволяют объединять различные типы клеток. Слияние клеток, принадлежащих к разным биологическим видам, называется соматической гибридизацией. Сущность соматической гибридизации заключается в получении синтетических культур путем слияния протопластов различных видов организмов. Для слияния клеток используют различные физические и химические методы. После слияния протопластов образуются многоядерные гетерокариотические клетки. В дальнейшем при слиянии ядер образуются синкариотические клетки, содержащие в ядрах хромосомные наборы разных организмов. При слиянии антителообразукицих клеток (например, В-лимфоцитов человека) и раковых клеток (например, клеток миеломы мышей) образуются гибридомы — клеточные гибриды, сохраняющие свойства лимфоцитов (способность к образованию строго определенных антител) и свойства раковых клеток (способность к неограниченному числу делений). Гибридомы вырабатывают однородные антитела, взаимодействующие со строго определенными возбудителями заболеваний или другими антигенами. Такие антитела называют моноклональными.

ЗНАЧЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ

1.3.2. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ: ДОСТИЖЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ.
ВОЗМОЖНОСТИ КОРРЕКЦИИ ГЕНОТИПА
ПРИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

Генная инженерия представляет собой совокупность методов, позволяющих создавать синтетические системы на молекулярно-биологическом уровне.

Генная инженерия дает возможность конструировать функционально активные структуры в форме рекомбинантных ДНК вне биологических систем (in vitro), а затем вводить их в клетки.

Генная инженерия возникла в 1972 г., когда в лаборатории П. Берга (Станфордский университет, США) была получена первая рекомбинантная (гибридная) ДНК (рекДНК), в которой были соединены фрагменты ДНК фага лямбда и кишечной палочки с кольцевой ДНК обезьяньего вируса SV40. С конца 80-х гг. XX в. генетически модифицированные растения начинают использоваться в сельском хозяйстве.

Методы генной инженерии основаны на получении фрагментов исходной ДНК и их модификации.

Для получения исходных фрагментов ДНК разных организмов используется несколько способов:

Определение нуклеотидного состава фрагментов ДНК производится с помощью радиоактивных зондов — молекул ДНК с заранее известной структурой, в состав которых входят радиоактивные изотопы фосфора или водорода. Если структура выделенного фрагмента хотя бы частично комплементарна структуре зонда, то происходит ДНК–ДНК–гибридизация, и на микрофотографии препарата появляется засветка от радиоактивного изотопа.

Выделенные участки ДНК встраивают в векторы переноса ДНК. Векторы — это небольшие молекулы ДЕК, способные проникать в другие клетки и реплицироваться в них.

В состав вектора входит не менее трех групп генов.

Для внедрения векторов в прокариотические или эукариотические клетки используют различные способы.

В качестве векторов часто используют плазмиды — кольцевые молекулы ДНК прокариотических клеток, а также ДНК вирусов. У эукариот в качестве векторов используют мобильные генетические элементы — участки хромосом, способные образовывать множество копий и встраиваться в другие хромосомы. В составе одного вектора можно комбинировать различные фрагменты ДНК (различные гены). Вновь образованные фрагменты ДНК называют рекомбинантными.

Природа создала естественный инструмент для переноса генов в растения — плазмиды агробактерий.

Плазмиды — это кольцевые молекулы ДНК, способные размножаться (реплицироваться) в клетке независимо от цикла размножения клетки. «Дикие» плазмиды очень широко распространены в природных бактериальных популяциях и способны передаваться от одной бактериальной клетки к другой в процессе конъюгации — аналога полового размножения. Плазмиды несут гены устойчивости к антибиотикам, гены ферментов, необходимых для утилизации необычных органических веществ и другие полезные гены, выгодные бактериальным клеткам. Плазмиды стали настоящим подарком для молекулярных биологов, сейчас на их основе созданы многие современные «векторные» системы, используемые в генной инженерии. Векторами называют искусственно полученные из вирусов и плазмид кольцевые молекулы ДНК, способные переносить целевые гены от одной клетки к другой по желанию экспериментатора.

Агробактерии обладают уникальным механизмом, благодаря которому определенный фрагмент плазмиды, называемый т-ДНК, переходит в ядро растительной клетки и становится частью хромосомной ДНК.

Используя это свойство, исследователи нагружают т-ДНК целевыми генами и получают возможность переносить их в геном растений сравнительно быстро, эффективно и просто.

На рисунке 4 показано, как воздействуют на микроорганизм (в данном случае на бактерию), заставляя ее синтезировать желаемое вещество. Кроме ДНК, в своем клеточном ядре бактерия (1) содержит плазмиду, представляющую собой молекулу ДНК кольцевой формы, которая находится вне ядра в цитоплазме.

Рекомбинация ДНК

Эта плазмида изолируется (2) и с помощью рестриктирующего фермента раскрывается в точно определенном месте (3). Тем временем с помощью других рестриктирующих ферментов из ДНК другого организма выделяют гены, определяющие синтез желаемого вещества (4). С помощью других ферментов этот ген встраивают в ранее открытую плазмиду (5). Плазмиду возвращают назад в бактерию (6). После этих манипуляций бактерии помещают в культуральную среду, где они синтезируют желаемое вещество (7).

Векторы переноса ДНК вместе с внедренными фрагментами ДНК различными способами вводят в прокариотические или эукариотические клетки и получают трансгенные клетки. В ходе размножения трансгенных клеток происходит клонирование требуемых фрагментов ДНК, в частности отдельных генов. Клонированные гены эукариот подвергают различным модификациям (например, добавляют перед ними сильные промоторы) и внедряют в клетки-продуценты. Основная проблема состоит в том, чтобы чужеродные гены экспрессировались постоянно, т. е. должен происходить синтез необходимых веществ без ущерба для клетки-хозяина.

Практические достижения современной генной инженерии заключаются в следующем:

Возможности генной инженерии практически безграничны. В настоящее время интенсивно изучается возможность коррекции генома человека (и других организмов) при генетических и негенетических заболеваниях.

Рассмотрим несколько примеров.

Нынешний этап развития генетической инженерии растений получил название «метаболическая инженерия». При этом ставится задача не столько улучшить те или иные имеющиеся качества растения, как при традиционной селекции, сколько научить растение производить совершенно новые соединения, используемые в медицине, химическом производстве и других областях. Этими соединениями могут быть, например, особые жирные кислоты, полезные белки с высоким содержанием незаменимых аминокислот, модифицированные полисахариды, съедобные вакцины, антитела, интерфероны и другие «лекарственные» белки, новые полимеры, не засоряющие окружающую среду, и многое, многое другое. Использование трансгенных растений позволяет наладить масштабное и дешевое производство таких веществ и тем самым сделать их более доступными для широкого потребления.

Важнейшим сырьем для получения разного рода химических веществ являются жирные кислоты — основной компонент растительного масла. В 1995 г. была закончена экспериментальная проверка и получено разрешение от федеральных властей США на выращивание и коммерческое использование трансгенных растений рапса с измененным составом растительного масла, включающего вместе с обычными 16- и 18-член- ными жирными кислотами также и до 45% 12-членной жирной кислоты — лаурата. Это вещество широко используется для производства стиральных порошков, шампуней, косметики. Экспериментальная работа заключалась в том, что был клонирован ген специфической тиоэстеразы из растения Umbellularia califonica, где содержание лаурата в жире семян достигало 70%. Структурная часть гена этого фермента под контролем промотора-терминатора гена белка, специфического для ранней стадии семяобразования, была встроена в геном рапса и арабидопсиса, что и привело к увеличению содержания лаурата в масле этих растений.

Для борьбы с насекомыми-вредителями в растениеводстве используются химические средства — инсектициды. Однако они оказывают вредное влияние на млекопитающих, убивают и полезных насекомых, загрязняют окружающую среду, дороги, и, кроме того, насекомые довольно скоро приспосабливаются к ним. Известно более 400 видов насекомых, устойчивых к используемым инсектицидам. Поэтому все большее внимание привлекают биологические средства борьбы, обеспечивающие строгую избирательность действия и отсутствие адаптации вредителей к применяемому биопестициду.

Уже довольно давно известна бактерия Bacillus thuringiensis, продуцирующая белок, являющийся очень токсичным для многих видов насекомых, в то же время безопасный для млекопитающих. Белок (дельта-эндотоксин, СЛГ-белок) продуцируется различными штаммами В. thuringiensis. Взаимодействие токсина с рецепторами строго специфично, что усложняет подбор комбинации токсин-насекомое. В природе найдено большое количество штаммов В. thuringiensis, чьи токсины действуют только на определенные виды насекомых. Препараты В. thuringiensis в течение десятилетий использовали для контроля насекомых на полях. Безопасность токсина и его составных белков для человека и других млекопитающих полностью доказана. Встраивание гена этого белка в геном растений дает возможность получить трансгенные растения, не поедаемые насекомыми.

В настоящее время методы клонирования растений достигли такого высокого уровня, при котором из одной клетки можно в лабораторных условиях получить полноценное растение. На рисунке 5 схематически показан процесс клонирования, примененный профессором Джеймсом Ф. Шепардом и его коллегами в Университете штата Канзас для получения полного растения картофеля из протопластов (живых клеток, стенки которых разрушены), приготовленных из клеток листа. С молодого растения картофеля берутся маленькие верхушечные листки (1). Затем их помещают в раствор, содержащий комплекс ферментов, способных разрушать стенки клеток, и получают протопласты (2). Под действием раствора ферментов протопласты высвобождаются из клеточной оболочки и приобретают сферическую форму, защищая, таким образом, протоплазму (3). Далее протопласты развиваются в культуральной среде (4), где происходит их деление и синтез новых клеточных оболочек (5). В этих условиях в течение двух недель каждый протопласт дает колонию недифференцированных клеток, или микрокаллюсов (6). В другой культуральной среде эти микрокаллюсы развиваются в каллюсы обычного размера (7); их клетки начинают дифференцироваться, образуя примордиальный побег (8). В третьей культуральной среде этот побег развивается в уже имеющее корни растеньице, которое высаживается в почву (9). При соответствующих условиях могут быть слиты протопласты двух различных растений, в результате чего получается клетка, обладающая генами растений, которые не поддаются скрещиванию классическими методами. Такое развитие растения из слившихся протопластов двух различных растений получило название «процесс соматической гибридизации».

Соматическая гибридизация картофеля

Лечение заболеваний с помощью генов получило название генотерапии. Сейчас в мире насчитывается порядка 400 проектов, посвященных лечению с помощью генотерапии. Заместительная генотерапия заключается во вводе в клетку неповрежденного гена. Внесенная копия заменит по функциям сохранившийся в геноме больного дефектный ген. Все проводимые сегодня клинические испытания используют внесение в клетку дополнительных количеств ДНК.

При корректирующей терапии предполагается замена дефектного гена нормальным в результате рекомбинации. Пока этот метод на стадии лабораторных испытаний, так как эффективность его еще очень низка, но последние исследования показывают успехи в лечении некоторых заболеваний.

Амавроз Лебера — врожденная слепота, редкая форма наследственного заболевания, которое проявляется уже в младенчестве. Из-за дефектного гена — Retinal Pigment Epithelium, 65 kDa (RPE65) — в сетчатке умирают и не восстанавливаются светочувствительные клетки. По статистике, от амавроза Лебера страдает один человек на 81 тысячу. Болезнь сопровождается ослаблением или полной потерей зрения без анатомического нарушения структуры органов. Традиционная лекарственная терапия бессильна в борьбе с этим заболеванием. На помощь пришла генотерапия. Исследователи из США и Англии делали инъекцию вирусного вектора, содержащего исправленный ген в один глаз пациентов, страдающих амаврозом Лебера. Вектор содержал фермент, необходимый для продукции светочувствительного пигмента, и вводился в эпителий пигментного слоя сетчатки. В первом исследовании у всех 12 пациентов светочувствительность в «пролеченном» глазу вернулась. У 4 детей зрение восстановилось до такой степени, что они могли заниматься спортом и нормально учиться в школе. Кроме того, были проведены исследования на саймири (беличьи обезьянки), страдающих дальтонизмом. Инъекция «исправленных» генов вернула им полное цветовое зрение.

Список наследственных заболеваний, которые пытаются или планируют лечить генами, велик. Это и ревматоидный артрит, и фенилкетонурия, и заболевания, связанные с недостатком гормонов (инсулина, эритропоэтина, гормона роста). В случае хронической анемии, связанной с дефицитом эритропоэтина, на основании опытов на животных предлагается принципиально новый подход к лечению. Так как каждая из наших клеток содержит один и тот же геном, можно заставить фибробласты кожи, которые в норме не производят эритропоэтина, синтезировать этот гормон. Для этого нужно ввести в геном новую контролирующую область и тем самым снять запрет со считывания (экспрессии) гена эритропоэтина, присутствующего, но «молчащего» в фибробластах.

Практически в любой области медицины либо начаты клинические испытания лечения наследственных заболеваний с помощью генотерапии, либо в опытах на животных разрабатываются подходы к такому лечению. По мере усовершенствования методов доставки генов и контроля их экспрессии список заболеваний, к которым можно применять генотерапию, будет, безусловно, расширяться.

Генотерапия применима не только к наследственным заболеваниям. Предстоит решить проблему лечения генами «чумы XX века» — синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), возникающего при заражении вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ). ВИЧ представляет собой ретровирус, поражающий Г-лимфоциты и макрофаги. Болезнь удалось бы победить, если бы были найдены новые гены, введение которых в зараженные ВИЧ лимфоциты останавливало бы дальнейшее размножение вируса. Предложено множество хитроумных способов борьбы со СПИДом с помощью привнесенных генов. Все они основаны на новейших данных о строении и функционировании генома ретровируса. Например, вводя прямо в мышцы больного ретровирусные векторы, несущие отдельные гены ВИЧ, ученые рассчитывали на то, что гены ВИЧ после внедрения в ДНК хромосом хозяина смогут дать информацию для синтеза вирусных белков и произойдет «противоСПИДная» иммунизация больного этими белками. Однако еще не получено ощутимых результатов, которые сулили бы успех в борьбе с вирусом дикого типа, коварство которого заключается в его изменчивости.

Огромные перспективы открывает использование генотерапии для лечения онкологических заболеваний. Трансгенных животных можно использовать для изучения наследственных заболеваний мозга и нервной системы. Гены болезни Альцгеймера (отложение белка р-амилоида приводит к образованию характерных бляшек) и гены, отвечающие за развитие эпилепсии, болезней мозга вводятся в геном нормальных животных; при этом получают трансгенных животных-моделей, на которых можно испытывать различные терапевтические приемы.

Трансгенных животных стали использовать для исследования воспалительных и иммунологических заболеваний человека, например, ревматоидного артрита. Моделируются болезни, связанные с липидным обменом.

1.3.3. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ

В биотехнологии обычно используются чистые культуры микроорганизмов-продуцентов, так как это позволяет получить продукт с заранее известными свойствами. Применяются штаммы микроорганизмов — микроорганизмы одного вида, выращенные в определенных условиях, вследствие чего обладающие определенными свойствами, которые отличаются от других чистых культур данного вида.

Не все микроорганизмы могут быть использованы в промышленных условиях, а лишь микроорганизмы-продуценты, обладающие способностью под воздействием внешних факторов (состава среды, условий культивирования, температуры, рН среды и т. д.) образовывать в больших количествах преимущественно то соединение, которое является главным (целевым) продуктом данного производства. К микроорганизмам-продуцентам предъявляется ряд требований. Микроорганизмы должны:

Сверхсинтез — способность микроорганизма синтезировать определенный продукт в количествах, превосходящих физиологические потребности,— часто встречается в природе. Микроорганизмы с такими свойствами первыми были использованы в хозяйственной деятельности человека, и таким образом был проведен стихийный отбор наиболее продуктивных форм.

В промышленности применяют три вида штаммов: природные штаммы, нередко улучшенные естественным или искусственным отбором; штаммы, измененные в результате индуцированных мутаций; штаммы культуры, полученные методами генной или клеточной инженерии.

Часто путем отбора не удается получить высокоактивные продуценты, поэтому возникает задача изменения природы организма в нужном направлении. Для этого используют методы селекции. Селекция— это направленный отбор мутантов, т. е. микроорганизмов, наследственные признаки которых претерпели изменения в нужном для человека направлении.

Природные штаммы микроорганизмов не обладают способностью выделять и накапливать в питательной среде такое количество нужного продукта, которое обеспечило бы низкую его стоимость и требуемый объем производства. Поэтому задачей селекции является не только усиление природной способности микроорганизмов продуцировать определенное вещество (ферменты, антибиотики, аминокислоты и т. д.), но во многих случаях и создание продуцента «заново» из штамма дикого типа, способного синтезировать вещество, но не способного его продуцировать.

Эти задачи осуществляются получением у природных штаммов наследственных изменений — мутаций, влияющих на фенотип (физиологические и морфологические признаки) клетки. Спонтанные (происходящие случайным образом) мутации помогают микробным популяциям приспосабливаться к новым условиям существования. Мутации приводят к усилению природной способности микроорганизмов синтезировать и продуцировать определенное вещество, а также к появлению новой способности— синтезировать вещество в избытке (сверх своих потребностей) и продуцировать его.

Для ускорения селекции используют индуцированный мутагенез, применяя мутагенные факторы физической, химической и биологической природы. К универсальным физическим мутагенам относятся ультрафиолетовое облучение (УФО), рентгеновские лучи и др.; химические факторы мутагенного воздействия — азотистый иприт, нитрозамины, четыреххлористый углерод и другие химикаты; биологическими мутагенами являются фаги (вирусы микроорганизмов).

Таким образом, селекционированные штаммы микроорганизмов обладают определенными ценными наследственно закрепленными свойствами.

Источник