что такое днк чип
Микрочипы в вакцинах? Анализ крови даёт удивительные результаты
Дискуссии о вакцинах и вакцинации от COVID-19 не затухают, а, наоборот, становятся всё более горячими. Даже серьёзные медики сомневаются, что у них есть полное представление о составе тех препаратов, которыми делаются прививки. Что же там находится на самом деле?
От чего умирают люди?
Скепсис российских медиков лишь усилился после недавнего заявления академика А. Гинцбурга (Институт Гамалеи, разработчик линейки «Спутников»). Он упомянул какие-то «маркеры» в препарате «Спутник V», которые позволяют определить, кто вакцинацию проходил, а кто лишь купил справку о вакцинации. Об этих «маркерах» в официальной информации о «Спутнике V» ничего не говорится.
Масла в огонь споров и сомнений по вопросу о составе прививочных препаратов добавила конференция учёных-патологоанатомов, которая прошла 20 сентября этого года в Германии в Институте патологии в Ройтлингене (Pathologischen Institut in Reutlingen). В мероприятии, как отмечают СМИ, участвовало от 30 до 40 специалистов, в том числе из Австрии. Ключевыми фигурами были:
Скриншот страницы pathologie-konferenz.de/en/
В центре внимания участников конференции были результаты вскрытий восьми умерших после вакцинации от COVID-19, которые проводились в этом году под руководством профессора Арне Буркхардта. Результаты упомянутых вскрытий удивительным образом подтверждают выводы коллеги Арне Буркхардта профессора, доктора Питера Ширмахера (Prof. Dr. Peter Schirmacher). Последний сделал вскрытия более 40 умерших, имевших инфицирование вирусом ковида. Питер Ширмахер уверенно заявил, что около трети из них умерли не от ковида, а от вакцинации против ковида.
Эти заявления были сделаны летом, власти и подконтрольные им СМИ пытались замолчать или опровергать выводы профессора. И вот подоспела конференция патологов в Ройтлингене, которая вновь вскрыла смертельную опасность вакцинаций против ковида.
Они уже в нас
Конференция транслировалась по видеосвязи. На ней были представлены многочисленные фотографии и рисунки, наглядно дополнявшие картину, которую описывали выступавшие патологи.
Анализ тонких тканей умерших проводился с помощью специального, так называемого «темнопольного» микроскопа. Он позволил выявить содержание в тканях посторонних микрочастиц, которые по форме представляют собой явно неживые структуры достаточно правильной геометрической формы. Внешне они выглядят… как микросхемы!
Скриншот кадра видео Cause of death after COVID-19 vaccination & Undeclared components of the COVID-19 vaccines / odysee.com
Версий появления таких инородных объектов две. Либо они были введены в кровоток готовыми, либо сформировались в организме человека из наночастиц, содержащихся в вакцине. Случайное попадание посторонних частиц в тело человека исключается, поскольку одни и те же инородные объекты выявлены у всех умерших после вакцинации.
Упомянутый выше профессор, доктор Вернер Берггольц как специалист по микрочипам высказал своё мнение по поводу «открытия» патологов. Он не исключает возможности использования выявленных в тканях умерших частиц в качестве тех самых «маркеров» и «идентификаторов», о присутствии которых в вакцинах высказывали подозрения сторонники так называемой «теории заговора».
Pfizer с дополнениями
Это размышление профессора вполне корреспондирует с мнением тех специалистов, которые пытались и пытаются выявить «маркеры» вакцин без вскрытия, путём углублённого химического и физического изучения самих препаратов. Есть ряд исследований, в которых говорится об обнаружении в составе по крайней мере двух препаратов – Pfizer и Moderna (мРНК-вакцины) – графена (также оксид графена), который никакой медицинской роли не выполняет, но вполне годится на роль «маркера», «идентификатора». Масла в огонь добавило заявление Карен Кингстон (Karen Kingston), бывшей сотрудницы компании Pfizer. Кингстон утверждает, что хотя и в патентах на вакцину Pfizer оксид графена не упоминается, он фигурирует в ряде сопроводительных документов.
Скриншот кадра видео Stew Peters show «Former Pfizer Employee Confirms Poison in COVID ‘Vaccine’»/ redvoicemedia.com
Ещё одно направление изучения «пытливыми скептиками» необъявленных производителями вакцин компонентов и свойств препаратов – попытки идентифицировать получивших вакцины людей с помощью специальных технических средств. Та яростная энергия, с которой «Силиконовая мафия» (ведущие IT-корпорации, контролирующие интернет и социальные сети) удаляет публикации подобного рода, также наводят на мысль, что нет дыма без огня.
Трудно поверить, что сказанное на конференции в Ройтлингене по поводу инородных частиц в прививочных препаратах – лишь «дым», который быстро рассеется. Дыма без огня не бывает. Просто этот огонь тщательно скрывают. До того момента, когда начнется вселенский пожар, который уже не остановишь.
Участники конференции приняли резолюцию с призывом к властям Германии, Австрии и других стран начать проводить массовые патологоанатомические исследования умерших после вакцинаций от ковида, обращаться с соответствующими запросами к производителям препаратов и, конечно же, немедленно остановить дальнейший процесс прививок от COVID-19 до полного прояснения вопроса.
Казалось бы, при чём тут Гейтс?
Идея вживления микрочипа в тело человека через прививочный укол вынашивалась мировой элитой давно. В «Prevent Disease.Com» (электронном издании США, специализирующемся на разоблачении планов американской и международной «медицинской мафии») ещё в 2009 году появилась статья «Are Populations Being Primed For Nano-Microchips Inside Vaccines?». Название статьи на русском: «Подталкивается ли население к принятию наночипов, упрятанных в вакцины?». Как отмечалось в указанной статье, ещё в последние годы ХХ века удалось разработать микрочипы нового поколения, основанные на использовании нанотехнологий. Сверхкомпактные (не больше пылинки, радиус порядка 5 микромиллиметра, что примерно в 10 раз меньше радиуса волоса) и недорогие. Вот что, в частности, говорилось в указанной выше статье: «Запущенный Всемирной организацией здравоохранения сценарий с пандемией свиного гриппа как нельзя лучше подходит для пропаганды и принуждения населения добровольно согласиться на введение микрочипов через нановакцины. Всё это будет сделано под лозунгом «высшего блага» для человечества».
Пять лет тому назад была запущена частно-государственная инициатива под кодовым названием «ID2020». Её инициатором был Билл Гейтс, основатель и руководитель IT-корпорации Microsoft, одновременно основатель и руководитель крупнейшего в США благотворительного фонда. Инициатива была поддержана ООН. Суть её проста – провести глобальную цифровую идентификацию населения для того, чтобы мировая элита могла его держать под своим контролем. В первых выступлениях Билла Гейтса как главного энтузиаста тотальной цифровой идентификации он не скрывал, что идентификация через чипизацию является самым простым и надёжным способом решения поставленной задачи.
Но встретив непонимание и даже гневные протесты со стороны ряда политиков и общественных деятелей, Гейтс больше эту идею не озвучивал. И, как считают некоторые эксперты, продолжал её двигать, давая деньги на разработки наночипов, которые станут «бесплатной добавкой» к прививочным препаратам. Решением задачи «наночип и вакцина в одном флаконе» занимались совместно, в тесной кооперации две структуры, находящиеся под контролем Билла Гейтса: упомянутое выше частно-государственное партнёрство «ID2020» и Альянс по вакцинациям GAVI (также частно-государственное партнёрство). Уже в 2018 году все упоминания о наночипах в составе вакцин были удалены с сайтов «ID2020» и GAVI.
Что с того?
Хотя с конференции в Ройтлингене прошло почти два месяца, вы наверняка ничего про неё не слышали – и это яркий пример контроля, установленного «Силиконовой мафией» над каналами распространения информации.
Видео и другие материалы конференции блокируют всеми возможными способами, а там, где нельзя заблокировать, выступают с плакатными «разоблачениями» прозвучавших там «фейков».
Чего только не сделаешь ради воспитания в людях доверия к «спасительным» вакцинам!
Биочипы — высокие технологии в медицинской диагностике
Открытие функционального значения тысяч генов и молекулярных механизмов действия множества ферментов стало революционным событием в биологии, оказавшим и продолжающим оказывать огромное влияние на развитие медицины XXI в. Перед учеными и медиками открылись уникальные возможности для выяснения причин многих инфекционных и наследственных заболеваний, а также разработки эффективных методов их лечения. В свою очередь, развитие новых диагностических методов потребовало и создания новых технологий многопараметрического анализа биологических образцов, с помощью которых можно одновременно исследовать множество белковых и ДНК-маркеров различных заболеваний, функционально-значимых биологических макромолекул и их комплексов. Так появилась технология биологических микрочипов, способных, подобно микрочипам электронным, извлекать и обрабатывать огромные массивы информации из одного небольшого образца биологического материала, полученного от конкретного пациента.
Об авторах
Дмитрий Александрович Грядунов — кандидат биологических наук, заместитель директора по научной работе и заведующий лабораторией технологий молекулярной диагностики Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН (Москва). Лауреат Государственной премии РФ для молодых ученых (2003), российской Премии Галена (2014). Автор и соавтор 60 научных работ и 27 патентов.
Александр Сергеевич Заседателев — доктор физико-математических наук, профессор, заведующий лабораторией биологических микрочипов Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН (Москва), заведующий кафедрой молекулярной и клеточной биологии Московского физико-технического института. Лауреат российской Премии Галена (2014), кавалер ордена Академических Пальм Франции (2016). Автор и соавтор 190 научных работ и 37 патентов.
За последние десятилетия был накоплен огромный объем знаний о молекулярных основах биохимических процессов в живых организмах. Это дало возможности не только точно диагностировать то или иное заболевание, но и оценить вероятность его возникновения еще до проявления у пациента клинических симптомов, а также подобрать эффективную терапию. Подавляющую часть такой информации получают с помощью лабораторной диагностики, на которую в мире ежегодно расходуется свыше 100 млрд долларов. В России в 1970 г. она насчитывала 81 биохимический / молекулярный тест, в 2000 г. — 170, а сегодня число тестов измеряется тысячами!
Большинство важнейших современных методов молекулярной диагностики основано на анализе данных, полученных при исследовании структуры геномов человека и микроорганизмов. В первую очередь речь идет о полимеразной цепной реакции (ПЦР). Обычно ДНК содержится в образцах в минимальных количествах, однако с помощью ПЦР можно в миллионы раз «размножить» в исследуемой пробе биоматериала определенные фрагменты этих макромолекул. «Мишенями» могут служить бактериальные или вирусные гены, генетические маркеры раковых опухолей и т. п. С помощью этого метода можно определить наличие, к примеру, возбудителя болезни, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул его ДНК.
Однако возможности методов, базирующихся на ПЦР, ограничены в случае, когда речь идет об одновременном анализе десятков и сотен различных биомаркеров. И здесь на первый план выходит уже успешно зарекомендовавшая себя технология биологических микрочипов (биочипов). Достоинство этой технологии в том, что тест проводится в формате «один образец — один реакционный объем биочипа», т. е. образец не нужно разделять на несколько частей и их отдельно анализировать. Такой формат намного повышает чувствительность анализа и снижает его трудоемкость и стоимость, что дает возможность клинико-диагностическим лабораториям тестировать десятки и сотни образцов за одну рабочую смену.
Сегодня ведущие научные журналы регулярно публикуют обзоры, посвященные биологическим микрочипам, которые производят многие десятки компаний, а объем продаж составляет сотни миллионов долларов в год. Вместе с тем сама идея создания биочипов родилась лишь четверть века назад, и одним из мест рождения этой технологии стал Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук.
С самого начала подход российских исследователей отличался удачным выбором ключевых технологических решений, благодаря которым технологии биочипов ИМБ РАН продолжают оставаться конкурентоспособными в мировой науке. Многие из этих подходов (например, замена радиоактивных меток на флуоресцентные, применение гидрогеля и элементов сферической формы) стали использовать в своей работе другие исследователи, занимающиеся разработкой биочипов. А с 2000 г. в ИМБ РАН при поддержке Международного научно-технического центра начались работы по созданию биочипов для медицинской диагностики возбудителей социально значимых заболеваний.
В 2011 г. Национальная ассоциация фтизиатров России наградила ИМБ РАН кубком и дипломом «Лучший инновационный проект» за разработку молекулярно-генетической технологии биологических микрочипов и создание тест-системы для диагностики туберкулеза на ее основе. Согласно расчетам, выполненным ФГУ «Центральный НИИ организации и информатизации здравоохранения», «. экономия бюджетных средств при внедрении технологии биочипов для диагностики туберкулеза и определения лекарственной чувствительности возбудителя составляет не менее 70 рублей на каждый вложенный рубль» (Министерство здравоохранения и социального развития РФ, 2009).
Биочипы в деле
Главным элементом любого биочипа служит матрица из сотен и тысяч микроячеек, каждая из которых содержит так называемые молекулярные зонды — молекулы, способные специфично связываться только со строго определенными биологическими молекулами или их фрагментами. Зондами могут служить олигонуклеотиды, участки геномной ДНК, РНК, антитела, олигосахариды, различные низкомолекулярные соединения и др. Каждая ячейка биочипа служит своего рода отдельной «нанопробиркой», где иммобилизованный зонд распознает в анализируемом образце только свою мишень. Таким образом удается проводить параллельное распознавание сразу множества мишеней, например, генов, ответственных за лекарственную устойчивость возбудителя болезни.
В биочипе ячейки с иммобилизованными зондами располагаются упорядоченными рядами, причем каждая ячейка содержит уникальный зонд. В зависимости от типа биочипа диаметр ячеек варьирует от 50 до 300 мкм, а их число зависит от сложности анализируемой мишени(ей) и задач эксперимента и составляет от нескольких десятков до нескольких тысяч. Молекулы исследуемого образца помечают флуоресцентой меткой, поэтому при облучении светом определенной длины волны ячейки, где произошло связывание зондов с молекулами-мишенями, будут светиться (две крайние ячейки)
Принципиальное отличие технологии матричных биочипов, разработанной в ИМБ РАН, в том, что зонды располагаются не на плоской подложке, а в заполимеризованных «каплях» гидрогеля полусферической формы. Размещение молекулярных зондов в трехмерном объеме, а не на плоскости, дает ряд существенных преимуществ. Оно позволяет в десятки и сотни раз увеличить емкость биочипа на единицу поверхности и, соответственно, чувствительность измерений. Кроме того, гель — насыщенное водой желеобразное вещество, исключает возможность взаимодействия зондов друг с другом и с твердой поверхностью подложки, а также обеспечивает отличную изоляцию отдельных ячеек на биочипе.
Объемные гидрогелевые 3D-ячейки биочипов имеют ряд преимуществ в сравнении с поверхностными. Например, в гидрогеле иммобилизованные молекулы-зонды, в том числе белки, сохраняют свою активность, а емкость наполнения ячейки зондами в десятки раз выше, чем в «плоских» биочипах
Для регистрации результатов анализа используют флуоресцентные метки, которые вводят в молекулы образца. Если зонд специфично распознает и свяжется с мишенью, в ячейке возникает флуоресценция. Интенсивность свечения ячеек биочипа измеряется с помощью специальных аппаратно-программных комплексов-анализаторов, которые и выдают отчет о присутствии в исследуемом образце специфичных молекулярных мишеней, информирующих о наличии микроорганизмов или генных мутаций, онкомаркеров или аллергенов и т. п.
Анализатор биочипов состоит из оптико-электронного блока, системы лазеров для возбуждения флуоресценции и оптической части, совмещенной с CCD-камерой, которая передает изображение чипа на компьютер, где сигналы в каждой ячейке вычисляются и анализируются по определенному алгоритму. Для получения матрицы биочипа растворы молекул зондов смешивают с гелеобразующими добавками. Капли смеси наносят на поверхность полимерной подложки будущего чипа с помощью робота и облучают ультрафиолетовым светом, под действием которого идет полимеризация. В ходе реакции молекулярные зонды присоединяются к растущим полимерным цепям геля и в итоге равномерно распределяются по всему объему ячейки
Оригинальная технология создания таких гелевых чипов, разработанная в ИМБ РАН, была запатентована и сертифицирована по европейским стандартам. Биочипы, созданные по этой технологии, занимают отдельную нишу диагностических микроматриц и применяются в российских клиниках. Коммерческие микроматрицы, произведенные ведущими научно-производственными корпорациями Германии и США применяются, в основном, в исследовательских целях.
Россия — пионер «биочипостроения»
Большие матрицы с ДНК и белками, иммобилизованными на фильтре или зафиксированными в лунках планшета, были известны достаточно давно. Но идея о создании микрочипов современного формата появилась лишь в конце прошлого века. Первая работа по ДНК-микрочипам и одна из первых — по белковым чипам были опубликованы группой академика А. Д. Мирзабекова из московского Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта АН СССР (Khrapko et al., 1989; Arenkov et al., 2000).
Эта революционная идея родилась как предложение для нового метода секвенирования ДНК с использованием гибридизации — процесса объединения двух комплементарных одноцепочечных молекул ДНК в двуцепочечную. Работы по совершенствованию методик секвенирования были стимулированы все более возраставшим интересом к проблеме расшифровки генома человека.
Выдающийся молекулярный биолог, академик А. Д. Мирзабеков в лаборатории биологических микрочипов ИМБ РАН (Москва)
В то время в научной среде широко дискутировался вопрос, должна ли эта задача решаться масштабированием существующих подходов или нужно разрабатывать новые, более эффективные. Ученые сначала пошли по первому пути. Так, в 1977 г. появился «метод Сенгера», основанный на ферментативном синтезе комплементарной последовательности ДНК на матрице анализируемой одноцепочечной ДНК, а его разработчики получили в 1980 г. Нобелевскую премию. В своей нобелевской речи один из лауреатов, американский биохимик У. Гилберт, отметил, что «идея метода пришла только после второго визита А. Мирзабекова» в его лабораторию (Gilbert, 1984).
При секвенировании гибридизацией «расшифровка» ДНК идет не отдельными буквами-нуклеотидами, а «словами» определенной величины, и такой словарь может содержать тысячи слов. Стала очевидной необходимость создания микрочипов: в это время и вышла первая статья ученых из ИМБ, где были описаны приготовление и свойства гелевых микрочипов (Khrapko et al., 1989).
Технология производства гелевых биочипов прошла несколько этапов развития. Технология первого поколения, еще достаточно громоздкая и несовершенная, была разработана и запатентована в ИМБ в 1989–1993 гг., а впоследствии реализована в совместной лаборатории, организованной институтом и Аргоннской национальной лабораторией (США), и лицензирована американскими компаниями Motorola и Packard Instruments. Однако из-за технологических проблем фирмы стали производить биочипы, матрица которых представляла собой поверхность, сплошь покрытую полиакриламидным гелем.
В ИМБ РАН технология гелевых биочипов продолжала развиваться. Современная, достаточно простая, универсальная и дешевая технология позволяет производить даже в лабораторных условиях сотни и тысячи олигонуклеотидных, ДНКовых или белковых микрочипов в день (Колчинский и др., 2004).
Туберкулез и лекарственная устойчивость
Первой в мире тест-системой на основе биочипов, зарегистрированной для медицинского применения, стал разработанный в ИМБ в 2004 г. набор «ТБ-Биочип-1». С его помощью можно определить наличие в геноме микобактерии туберкулеза 47 мутаций, приводящих к устойчивости к двум основным противотуберкулезным препаратам — рифампицину и изониазиду.
Пример определения лекарственной чувствительности возбудителя туберкулеза к основным противотуберкулезным препаратам с помощью биочипа. Слева — флуоресцентная картина, свидетельствующая о чувствительности к стандартной терапии; справа — о наличии мутаций в ДНК, придающих возбудителю устойчивость к рифампицину и изониазиду, что требует перевода на схему лечения резервными препаратами. Свечение ячейки «ТБ» говорит о присутствии последовательности IS6110, однозначно свидетельствующей о принадлежности анализируемой ДНК возбудителю туберкулеза
Почему внимание исследователей привлек именно туберкулез? Дело в том, что многие десятилетия для борьбы с этой болезнью использовали комбинированное лечение сразу несколькими химиопрепаратами, чтобы повысить его эффективность. При монотерапии больные быстро приобретали устойчивость к лекарству. Однако такая стратегия привела к тому, что уже в конце прошлого века в мире, в том числе и в России, начал повсеместно распространяться туберкулез со множественной лекарственной устойчивостью. Именно этот фактор в наши дни чаще всего является причиной неудачного исхода лечения и возникновения рецидива болезни, от которой ежегодно в мире умирает более 3 млн человек.
Изониазид и рифампицин относятся к популярным и наиболее эффективным препаратам первого (основного) ряда. И если выделенный от пациента возбудитель окажется устойчивым к этим лекарствам, нужно обращаться к химиопрепаратам второго (резервного) ряда, к которым будет чувствительна эта бактериальная популяция. Сегодня одними из наиболее перспективных препаратов для лечения таких форм туберкулеза являются фторхинолоны. Поэтому следующей тест-системой в ряду диагностических тестов ИМБ стал «ТБ-Биочип-2», с помощью которого можно выявить лекарственную устойчивость к различным классам этих препаратов (Грядунов и др., 2009).
Все более широкое распространение форм туберкулеза со множественной лекарственной устойчивостью явилось стимулом для дальнейшей «эволюции» тест-системы. Требовалось, во-первых, максимально охватить весь спектр генетически детерминированной резистентности к широкому ряду противотуберкулезных препаратов. Во-вторых, возникла необходимость определять генотип и соответственно принадлежность выделенного штамма к основным семействам, циркулирующим на территории РФ, что важно не только для эпидемиологического мониторинга структуры популяции возбудителей туберкулеза, но и для назначения адекватной терапии.
Так в 2012–2013 гг. в результате масштабных геномных исследований был создан не имеющий мировых аналогов набор реагентов «ТБ-ТЕСТ», позволяющий одновременно идентифицировать 120 генетических локусов, отвечающих за развитие устойчивости к препаратам первой и второй «линии обороны»: рифампицину, изониазиду, этамбутолу, фторхинолонам и инъекционным препаратам (амикацину и капреомицину) (Zimenkov et al., 2016). Такая диагностика позволяет дифференцированно назначать высокие дозы химиопрепаратов или, напротив, удалять те или иные лекарства из схем терапии.
Флуоресцентная картина при анализе ДНК возбудителя туберкулеза особо опасного генотипа Beijing B0/W148, устойчивого ко всем противотуберкулезным препаратам. Красные точки — ячейки, по которым проведена идентификация мутаций. На структуре биочипа системы «ТБ-ТЕСТ» (слева) разными цветами отмечены группы ячеек с иммобилизованными в них олигонуклеотидными зондами, специфичными к вариантам генов, связанных с лекарственной устойчивостью к противотуберкулезным препаратам первого и второго ряда
Чтобы получить государственную регистрацию в Росздравнадзоре, тест-система прошла все виды испытаний и экспертиз и с 2014 г. разрешена к применению в медицинской практике РФ. В настоящее время «ТБ-ТЕСТ» приходит на смену наборам «ТБ-Биочип».
Тест-системами серии «ТБ-Биочип» и оборудованием для их анализа были оснащены 20 учреждений противотуберкулезной службы РФ и 8 бактериологических лабораторий Федеральной службы исполнения наказаний. Число излеченных больных с лекарственно-устойчивым туберкулезом увеличилось по меньшей мере в 3 раза при ранней постановке диагноза с использованием биочипов в отличие от диагностики традиционными методами (Gryadunov et al., 2011). В этом случае огромную роль играет такой фактор, как время анализа: в первом случае для диагностики достаточно нескольких часов, тогда как выращивание микобактерий на средах с разными противотуберкулезными препаратами занимает 2–3 месяца.
От гепатита до рака и аллергий
Еще одной актуальной проблемой мирового здравоохранения является лечение больных гепатитом С. Возбудитель этого вирусного заболевания может долгое время размножаться в печени, ничем не выдавая себя, а первые признаки болезни обнаруживаются лишь спустя пару месяцев после заражения. Еще недавно гепатит С считался практически неизлечимой болезнью, а основным терапевтическим средством служила комбинация из интерферона и рибавирина, которая зачастую оказывалась неэффективной и имела много негативных побочных эффектов.
Сегодня созданы новые антивирусные препараты, обладающие так называемым прямым противовирусным действием и блокирующие ключевые внутриклеточные этапы размножения возбудителя. Но вся сложность в том, что вирус гепатита С имеет 7 вариантов генотипа, при этом каждый генотип имеет еще несколько подтипов. Более того, разные генотипы / подтипы обладают и разной чувствительностью к традиционным и новым препаратам, и выбор противовирусной терапии должен проводиться в соответствии с генотипическими особенностями возбудителя.
В ИМБ РАН совместно с лабораторией вирусологии госпиталя Университета г. Тулузы (Франция) был разработан и запатентован не имеющий мировых аналогов подход, основанный на использовании платформы гидрогелевых биочипов для типирования вируса гепатита С на основе анализа области NS5B вирусного генома. Тест-система «HCV-Биочип», способная определять 6 генотипов и 36 подтипов этого вируса, успешно прошла клинические испытания в России и Франции (Gryadunov et al., 2011).
Тест-система «HCV-Биочип» используется для идентификации 6 генотипов и 36 подтипов вируса гепатита С на основе анализа региона NS5B вирусного генома. Справа — гибридизационная картина анализа конкретного образца и его интерпретация
Важнейшим направлением приложения технологии гидрогелевых биочипов служит анализ мутаций и полиморфизмов ДНК самого человека: ДНК-маркеров, ассоциированных с возникновением различных неинфекционных заболеваний.
Среди онкологических заболеваний у детей ведущее место занимают лейкозы. Тест-система «ЛК-Биочип» способна идентифицировать в образцах крови 13 наиболее клинически значимых хромосомных транслокаций (переносов фрагмента одной хромосомы на другую), характерных для некоторых типов острых и хронических лейкозов. Каждая из этих транслокаций определяет свой вариант развития лейкоза и важна для выбора стратегии лечения. Эта тест-система применяется в Национальном научно-практическом центре детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева (Москва), где анализируются образцы из 18 региональных гематологических центров РФ (Gryadunov et al., 2011).
Для ранней диагностики рака молочной железы и яичников создана тест-система «РМЖ-Биочип», которая позволяет определять мутации в генах BRCA1/2, ассоциированные с высокой (до 80%) вероятностью возникновения наследственных форм этих заболеваний.
В настоящее время в ИМБ РАН разрабатываются варианты тест-систем на основе биочипов для определения чувствительности злокачественных клеток к противоопухолевой терапии. Например, с помощью биочипа для индивидуального подбора препаратов, эффективно воздействующих на молекулярные мишени в опухолевых клетках меланомы, можно выявить мутации генов, которые определяют целесообразность использования таких препаратов таргетной («молекулярно-прицельной») терапии поздних стадий и рецидивов меланомы, как траметиниб, иматиниб и вемурафениб (Emelyanova et al., 2017).
Трехмерная структура гидрогеля, в котором на биочипах зафиксированы молекулярные зонды, позволяет сохранить без изменений достаточно «чувствительную» нативную структуру белковых молекул. Поэтому такие биочипы можно использовать также для исследования белок-белковых взаимодействий, что требуется, к примеру, при проведении различных видов иммунохимического анализа.
В ИМБ РАН удалось перевести такой классический анализ в формат микрочипа и адаптировать его для диагностики аллергических заболеваний. Совместно с германской биотехнологической компанией Dr. Fooke Laboratorien GmbH, предоставившей наборы природных и рекомбинантных аллергенов, была разработана и запатентована тест-система «Аллерго-Биочип» для параллельного количественного определения больших панелей аллерген-специфичных антител Е и G4 в сыворотке крови (Feyzkhanova et al., 2017).
В ячейках «Аллерго-Биочип» в качестве молекулярных зондов иммобилизованы экстракты 60 аллергенов, наиболее часто встречающихся в европейской части РФ. При проведении анализа сыворотку крови наносят на биочип и инкубируют, в результате чего образуются специфические комплексы антител с аллергенами. Для визуализации биочип обрабатывают вторичными флуоресцентно мечеными антителами, специфичными к антителам человека, а затем проводят регистрацию и обсчет сигналов от каждой ячейки и определяют концентрации комплексов с IgE по калибровочным кривым
Важно, что для анализа антител на 30 и более аллергенов на биочипе требуется очень небольшой (всего 60 мкл) объем сыворотки крови — ровно столько, сколько требуется для анализа на один аллерген традиционным иммуноферментным методом! Такое отличие особенно значимо в педиатрии. Лабораторный вариант этой тест-системы уже проходит доклинические испытания в Детской городской клинической больнице № 13 им. Н. Ф. Филатова (Москва).
Примеры изображений флуоресцентных картин и соответствующие профили концентраций, полученные при анализе образцов сывороток крови двух пациентов
Двенадцать специализированных тест-систем, созданных на основе технологии гидрогелевых биочипов в ИМБ РАН, получили разрешение к применению как медицинские изделия для лабораторной диагностики. Эти тест-системы успешно используются более чем в 50 научно-исследовательских и медицинских центрах РФ, стран СНГ и ЕС.
Технологии биочипов, разработанные в ИМБ РАН, защищены 42 отечественными и международными патентами. И эти технологии продолжают интенсивно развиваться. Разрабатываются новые подходы, позволяющие упростить и ускорить методики, интегрировать в единую процедуру все стадии проведения анализа: от обработки биологического образца до количественной идентификации в режиме реального времени.
Ядро системы — гидрогелевый биочип — будет в дальнейшем модифицироваться в зависимости от назначения диагностического теста, в то время как остальные компоненты уже сейчас являются унифицированными. Такие «лаборатории на чипе» позволят значительно улучшить качество лабораторной диагностики, снизить вероятность заражения медперсонала и в конечном счете повысить эффективность и сократить стоимость лечения.
Литература
1. Грядунов Д. А., Зименков Д. В., Михайлович В. М. и др. Технология гидрогелевых биочипов и ее применение в медицинской лабораторной диагностике // Медицинский алфавит. 2009. № 3. С. 10–14.
2. Заседателев А. С. Биологические микрочипы для медицинской диагностики // Наука и технологии в промышленности. 2005. № 1. С. 18–19.
3. Колчинский А. М., Грядунов Д. А., Лысов Ю. П. и др. Микрочипы на основе трехмерных ячеек геля: история и перспективы // Молекулярная биология. 2004. Е. 38. № 1. С. 5–16.
4. Arenkov P., Kukhtin A., Gemmell A., et al. Protein microchips: use for immunoassay and enzymatic reactions // Analytical Biochemistry. 2000. V. 278. N. 2. P. 123–131.
5. Emelyanova M., Ghukasyan L., Abramov I. et al. Detection of BRAF, NRAS, KIT, GNAQ, GNA11 and MAP2K1/2 mutations in Russian melanoma patients using LNA PCR clamp and biochip analysis // Oncotarget. 2017. V. 32. N. 8. P. 52304–52320.
6. Feyzkhanova G., Voloshin S., Smoldovskaya O. et al. Development of a microarray-based method for allergen-specific IgE and IgG4 detection // Clinical proteomics. 2017. doi: 10.1186/s12014-016-9136-7.
7. Gryadunov D., Dementieva E., Mikhailovich V. et al. Gel-based microarrays in clinical diagnostics in Russia // Expert review of molecular diagnostics. 2011. N. 11. P. 839–853.
8. Khrapko K. R., Lysov Yu. P., Khorlyn A. A. An oligonucleotide hybridization approach to DNA sequencing // FEBS Letters. 1989. V. 256. N. 1-2. P. 118–122.
9. Zimenkov D. V., Kulagina E. V., Antonova O. V., et al. Simultaneous drug resistance detection and genotyping of Mycobacterium tuberculosis using a low-density hydrogel microarray // Journal of antimicrobial chemotherapy. 2016. V. 71. N. 6. P. 1520–1531.